章銀良，黃天琪，郭浩彬，王悅，王明雷，陳科宇

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)是指美拉德反應(yīng)(Maillard reaction，MR)，即在一定條件下含羰基的碳水化合物與含氨基的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)之間的兩種基團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)，形成的棕黑色聚合產(chǎn)物[1-2]。MRPs中含有抗氧化活性的還原酮、呋喃、類黑精等物質(zhì)[3-5]。在食品加工過程中，合理利用好MRPs的天然抗氧化活性可以極大地提高食品安全性能、食品貯藏期、抗氧化活性等[6-7]。

目前有許多方法與指標(biāo)已經(jīng)應(yīng)用于食品中抗氧化活性的檢測(cè)，最常用的為通過抗氧化活性物質(zhì)清除自由基能力來反映食品的抗氧化性強(qiáng)弱[8]。電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance，ESR)是一種快速、簡(jiǎn)單、直接的方法，能以譜圖的形式直接反映自由基的種類及數(shù)量[9]。研究者們發(fā)現(xiàn)選用比色法測(cè)定樣品的抗氧化活性容易受到樣品本身的影響。如臧爽[10]發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓、黑布林本身的顏色能影響紫外分光光度計(jì)法對(duì)于樣品抗氧化活性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。郭學(xué)文等[11]發(fā)現(xiàn)，番茄紅素與DPPH在517 nm處都具有較強(qiáng)吸收值，使得紫外法所測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。目前對(duì)于MRPs的抗氧化性研究多采用UV法檢測(cè)，而隨著美拉德反應(yīng)條件的不同，MRPs褐變程度也截然不同[12-13]，這一差異極有可能會(huì)干擾到我們對(duì)于最優(yōu)條件的判斷，因此利用ESR法對(duì)MRPs抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)并和紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行比較有利于我們更好地判斷MRPs抗氧化活性能力大小，為深入研究MRPs抗氧化活性提供了參考依據(jù)。

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 試劑與材料

D-核糖(AR)、L-阿拉伯糖(AR)、L-精氨酸(AR)、L-賴氨酸(AR)、L-甘氨酸(AR)：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉(AR)、無水乙醇(AR)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH)(AR)：進(jìn)口試劑。

1.2 儀器設(shè)備

SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；E-scan Bruker電子順磁共振波譜儀 德國布魯克科技(北京)有限公司；FE20 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽、HH-S水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Tecan Spark 20M多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPs的制備

將實(shí)驗(yàn)樣品依次分為時(shí)間組、pH組、溫度組和比例組，制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的具體操作如下。

1.3.1.1 時(shí)間組

準(zhǔn)確稱量阿拉伯糖和賴氨酸各12.5 g(質(zhì)量比為1∶1)，溶解于450 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至500 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，置于100 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)20，40，60，80，100，120，140，160,180，200 min。每組反應(yīng)平行2次，反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測(cè)定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 pH組

準(zhǔn)確稱量阿拉伯糖和賴氨酸各1.25 g(質(zhì)量比為1∶1)，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，置于100 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)1 h，每組反應(yīng)平行2次。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測(cè)定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 溫度組

準(zhǔn)確稱量阿拉伯糖和賴氨酸各12.5 g(質(zhì)量比為1∶1)，溶解于450 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至500 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，分別置于40，60，80 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h。量取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，分別置于100，120，140 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)1 h。再取50 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，固定冷凝回流裝置于160，180，200 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測(cè)定，每組反應(yīng)平行2次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 比例組

準(zhǔn)確稱量阿拉伯糖和賴氨酸，使它們的質(zhì)量比分別為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，置于120 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測(cè)定，每組反應(yīng)平行2次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.5 種類組

準(zhǔn)確稱量一種糖(D-阿拉伯糖、D-核糖)和一種氨基酸(L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甘氨酸)各1.25 g，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至10.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻。用移液槍吸取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋螺口試管中，密封嚴(yán)實(shí)后，置于100 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測(cè)定，每組反應(yīng)平行2次，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

1.3.2.1 ESR法測(cè)定MRPs抗氧化活性

吸取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，渦旋振蕩。再吸取500 μL MRPs(等量去離子水溶液作為空白對(duì)照組)與2 mL 0.35 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩,混合均勻。暗反應(yīng)30 min后，立即放入電子順磁波譜儀的諧振腔中，待儀器自動(dòng)調(diào)諧完畢后按開始測(cè)量。將掃描譜圖導(dǎo)入WinEPR-Processing中，對(duì)DPPH自由基的ESR譜圖進(jìn)行二重積分(積分區(qū)域?yàn)?3450±0.01)～(3525±0.01) G)，將測(cè)量的二重積分值記為As。在相同操作條件下，以0.5 mL去離子水代替0.5 mL稀釋后的樣品溶液，作為空白組，并記錄其二重積分值，記為Ac。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力可由下式計(jì)算得出：

(1)

ESR測(cè)定條件：參考李輝等[14]的方法。頻率9.792069 GHz，功率5.00 mW，中心磁場(chǎng)3487 G，掃描寬度100 G，調(diào)制幅度2.27 G，調(diào)制頻率86.00 kHz，時(shí)間常數(shù)40.96，掃描時(shí)間83.88 s(20.97 s×4次)，橫坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)512，接收機(jī)增益為3.17×103。

1.3.2.2 紫外分光光度計(jì)法測(cè)定MRPs抗氧化活性

結(jié)合周紹琴等[15]、He等[16]的方法。取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，振蕩搖勻。再取1 mL MRPs(等量去離子水溶液作為空白對(duì)照組)與4 mL 0.1 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩，混合均勻。暗反應(yīng)30 min后，記錄其在517 nm處的吸光度值為As?？瞻捉M在517 nm處的吸光度值記作Ac。MRPs對(duì)DPPH自由基的清除能力可由公式(1)得出。

1.3.2.3 多功能微孔板讀數(shù)儀(酶標(biāo)儀)法測(cè)定MRPs抗氧化活性

用酶標(biāo)儀測(cè)定空板在517 nm處的OD值，隨后吸取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，渦旋振蕩。再吸取500 μL MRPs(等量去離子水溶液作為空白對(duì)照組)與2 mL 0.35 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩，混合均勻。暗反應(yīng)30 min后，吸取200 μL MRPs加入96孔板內(nèi)，所測(cè)得在517 nm處的OD值減去空板OD值記為As，空白組在517 nm處的OD值減去空板OD值記作Ac。MRPs對(duì)DPPH自由基的清除能力可由公式(1)得出。

酶標(biāo)儀參數(shù)：溫度25 ℃、波長517 nm、無蓋。

1.3.3 MRPs吸光度值測(cè)定

取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中，加入4.9 mL去離子水，配制成50倍稀釋液，振蕩搖勻。在517 nm處測(cè)量并記錄不同條件下MRPs的吸光度值。取不同種類的MRPs稀釋50倍，吸取200 μL加入至96孔板，用酶標(biāo)儀測(cè)量不同波長范圍下的OD值。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以無水乙醇作為溶劑，配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L的DPPH溶液，按照1.3.2.1與1.3.2.3所述方法測(cè)量并建立ESR與酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)曲線。以無水乙醇作為溶劑，配制0.025，0.033，0.05，0.0667，0.075，0.1，0.2，0.3 mmol/L的DPPH溶液，按照1.3.2.2所述方法測(cè)量并建立紫外分光光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 均勻?qū)嶒?yàn)因素水平設(shè)計(jì)

選取阿拉伯糖與賴氨酸組合，以DPPH自由基(DPPH·)清除率為檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)用酶標(biāo)儀、ESR、紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性研究，采用 U10×(108)均勻?qū)嶒?yàn)表，因素水平見表1。

表1 U10×(108)均勻試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of U10×(108) uniform experiment

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均做3次平行，采用WinEPR-Processing、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關(guān)方法進(jìn)行處理，并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析(差異顯著p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

ESR、酶標(biāo)儀、紫外分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 ESR(a)、多功能微孔板讀數(shù)儀(b)、 紫外分光光度計(jì)(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合圖Fig.1 Standard curve fitting diagrams of ESR (a), multifunctional microporous plate reader (b), UV spectrophotometer (c)

由圖1可知,DPPH濃度與ESR的強(qiáng)度和酶標(biāo)儀、紫外分光光度計(jì)的OD值均具有良好的線性關(guān)系，3種儀器的相關(guān)性系數(shù)R2均大于0.98，線性方程依次為y=8.4596x+0.0317(ESR)，y=5.2145x-0.0072(酶標(biāo)儀)，y=9.3812x+0.1072(UV)。因此從理論上來說，3種檢測(cè)儀器均可用于抗氧化活性研究。由圖1中b和c可知，紫外分光光度計(jì)法的相關(guān)系數(shù)大于酶標(biāo)儀法，因此當(dāng)選取的DPPH濃度較小時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量。

2.2 DPPH·清除率的測(cè)定

2.2.1 pH對(duì)DPPH·清除率的影響

pH對(duì)DPPH·清除率的影響關(guān)系圖見圖2。

圖2 pH對(duì)DPPH自由基清除率的影響關(guān)系圖Fig.2 Effect of pH on DPPH radical scavenging rate

由圖2可知，使用ESR測(cè)量的MRPs對(duì)DPPH·的清除率隨著pH值的增大而增大，在pH為12時(shí)達(dá)到最大，在酸性條件下(pH 3～7)，MRPs對(duì)DPPH·的清除率緩慢遞增且清除率非常低，當(dāng)模擬體系進(jìn)入到堿性后，MRPs對(duì)DPPH·的清除率迅速增大，說明堿性環(huán)境更加有利于MRPs中抗氧化活性物質(zhì)的生成。使用紫外分光光度計(jì)法與酶標(biāo)儀法測(cè)量的結(jié)果與ESR法結(jié)果不一致，UV法與酶標(biāo)儀法測(cè)量的MRPs對(duì)DPPH·的清除率隨著pH值的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。相同性在于在酸性條件下(pH 3～7)，MRPs對(duì)DPPH·的清除率呈現(xiàn)緩慢遞增趨勢(shì)，使用紫外法測(cè)得的MRPs對(duì)DPPH·的清除率在pH為9時(shí)達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。而使用酶標(biāo)儀所測(cè)的MRPs對(duì)DPPH·的清除率在pH為10時(shí)達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。這一差別可能來源于樣品自身OD值以及MRPs與DPPH反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物的OD值的影響。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)DPPH·清除率的影響

反應(yīng)溫度對(duì)DPPH·清除率的影響關(guān)系圖見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響關(guān)系圖Fig.3 Effect of reaction temperature on DPPH radical scavenging rate

由圖3可知，使用3種方法測(cè)量的MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高都呈現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)溫度為40～120 ℃時(shí)，MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高而增大，當(dāng)反應(yīng)溫度為120～200 ℃時(shí)，MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢(shì)。這說明提高溫度有利于MRPs中抗氧化活性物質(zhì)的生成，并且MRPs中抗氧化活性物質(zhì)總量具有一定的穩(wěn)定性，可能存在兩種形式：一種形式為，隨著溫度提升到120 ℃以上，MRPs中抗氧化活性物質(zhì)不再生成，且具有極強(qiáng)的耐熱性，不會(huì)隨著反應(yīng)溫度的提升而分解或者轉(zhuǎn)化；另一種形式為，當(dāng)溫度提升到120 ℃以上時(shí)，MRPs中抗氧化活性物質(zhì)會(huì)隨著溫度的升高而分解或者轉(zhuǎn)化，但與此同時(shí)有新的抗氧化活性物質(zhì)在不斷生成，而生成的速率與分解或者轉(zhuǎn)化的速率一致，呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。使用酶標(biāo)儀所測(cè)的MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率在40～60 ℃時(shí)出現(xiàn)了負(fù)值，這可能是受到了樣品OD值的影響。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響關(guān)系圖見圖4。

由圖4可知，使用3種方法測(cè)量的MRPs對(duì)DPPH·的清除率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長都呈現(xiàn)出先增大后穩(wěn)定的趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間為20～120 min時(shí)，MRPs抗氧化活性物質(zhì)迅速生成。反應(yīng)時(shí)間為120～200 min時(shí)，MRPs對(duì)DPPH·的清除率基本無明顯變化，說明 MRPs 中具有抗氧化活性的物質(zhì)形成于反應(yīng)的初始階段，同時(shí)在后期的反應(yīng)過程中，MRPs中具有抗氧化活性的物質(zhì)不會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的增長而分解，MRPs在模擬美拉德反應(yīng)體系中具有一定的穩(wěn)定性。使用酶標(biāo)儀所測(cè)得的MRPs對(duì)DPPH·的清除率在20 min時(shí)出現(xiàn)了負(fù)值，這可能是受到了樣品OD值的影響。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響關(guān)系圖Fig.4 Effect of reaction time on DPPH radical scavenging rate

2.2.4 反應(yīng)料液比對(duì)DPPH·清除率的影響

反應(yīng)料液比對(duì)DPPH·清除率的影響關(guān)系圖見圖5。

圖5 料液比(阿拉伯糖∶賴氨酸)對(duì)DPPH自由基 清除率的影響關(guān)系圖Fig.5 Effect of solid-liquid ratio (arabinose∶lysine) on DPPH radical scavenging rate

由圖5可知，使用ESR法測(cè)量的MRPs對(duì)DPPH·的清除率隨著賴氨酸在反應(yīng)體系中含量增大而升高，而使用UV法與酶標(biāo)儀法所測(cè)結(jié)果與ESR法相反，即MRPs對(duì)DPPH·的清除率隨著賴氨酸在反應(yīng)體系中含量增大而降低。使用紫外法研究的MRPs對(duì)DPPH自由基的清除率隨著阿拉伯糖在反應(yīng)體系中含量增大而增大，而ESR法與酶標(biāo)儀法則無規(guī)律，但是ESR法與酶標(biāo)儀法所測(cè)得的結(jié)果更為接近。使用3種方法得出不同的結(jié)果，極有可能是MRPs與DPPH·反應(yīng)后的反應(yīng)產(chǎn)物在517 nm處具有很強(qiáng)的吸收值，而這類抗氧化活性物質(zhì)的生成可能與賴氨酸有關(guān)，使用UV法與酶標(biāo)儀法測(cè)量的結(jié)果不一致在于DPPH含量不同，雖然酶標(biāo)儀法原理與紫外法一致(即都以517 nm處的OD值反映DPPH·的含量)，但是由于酶標(biāo)儀使用的DPPH含量更高，因此所受影響更小。

2.3 樣品OD值的測(cè)定

2.3.1 不同反應(yīng)條件下MRPs OD值的測(cè)定

圖6 不同反應(yīng)條件下MRPs OD值的變化關(guān)系曲線圖Fig.6 Change relation curves of OD values of MRPs under different reaction conditions

由圖6可知，不同條件的模擬體系下MRPs在517 nm處的吸光度值不同，隨著反應(yīng)溫度、時(shí)間的增加，樣品OD值呈現(xiàn)先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)。反應(yīng)溫度在40～120 ℃時(shí)，MRPs的OD值迅速增大，在120～200 ℃時(shí)，MRPs的OD值趨于穩(wěn)定。反應(yīng)時(shí)間在20～100 min時(shí)，OD值急速增大，隨后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，MRPs的吸光度值趨于穩(wěn)定。隨著pH值的增大，MRPs的吸光度值在不斷增大，在酸性條件下，MRPs的OD值增長較為緩慢，當(dāng)模擬體系進(jìn)入堿性條件時(shí)，MRPs的OD值迅速增大，在pH值為12時(shí)達(dá)到最大。隨著模擬體系中阿拉伯糖與賴氨酸的比例不同，MRPs的OD值也隨即變化。隨著反應(yīng)條件的變化，MRPs自身的OD值呈現(xiàn)了不同的變化，這是影響比色法結(jié)果準(zhǔn)確性的重要原因之一。

2.3.2 不同種類的MRPs對(duì)DPPH·清除率以及OD值的測(cè)定

為了驗(yàn)證2.3.1的猜想，選取6種不同組合的糖和氨基酸，進(jìn)行了MRPs OD值的測(cè)定。并且使用ESR法和紫外分光光度計(jì)法計(jì)進(jìn)行對(duì)比，其中紫外分光光度計(jì)法測(cè)定的DPPH·清除率采用了扣除樣品OD值以及未扣除樣品OD值的兩種算法，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，ESR法測(cè)量不同種類模擬反應(yīng)組合的MRPs對(duì)DPPH·的清除率由大到小依次為：核糖與賴氨酸>阿拉伯糖與賴氨酸>核糖與精氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>阿拉伯糖與精氨酸>核糖與甘氨酸。用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量不同種類模擬反應(yīng)組合的MRPs對(duì)DPPH·的清除率由大到小依次為：核糖與精氨酸>核糖與賴氨酸>阿拉伯糖與精氨酸>阿拉伯糖與賴氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>核糖與甘氨酸。減去樣品稀釋液吸光度值后計(jì)算不同種類模擬反應(yīng)組合的MRPs對(duì)DPPH·的清除率由大到小依次為：阿拉伯糖與賴氨酸>阿拉伯糖與甘氨酸>核糖與甘氨酸>核糖與賴氨酸>核糖與精氨酸>阿拉伯糖與精氨酸，這一結(jié)果與紫外法相比，減去樣品吸光度值后計(jì)算的DPPH·清除率和ESR法測(cè)量的結(jié)果更為接近，但是依舊不同，可能是由于MRPs中具有抗氧化活性的物質(zhì)在和DPPH·反應(yīng)后所生成的新產(chǎn)物在517 nm處依舊具有吸光度值。

圖 7 不同方法測(cè)定不同種類MRPs對(duì)DPPH·清除率Fig.7 Determination of DPPH· scavenging rate of different kinds of MRPs by different methods

圖8 不同種類的MRPs在不同波長處OD值變化曲線圖Fig.8 OD value variation curves of different kinds of MRPs at different wavelengths

由圖8可知，在517 nm處MRPs都具有一定的吸光度值，因此運(yùn)用紫外分光光度計(jì)法測(cè)量自由基清除率容易受到MRPs自身的影響而造成實(shí)驗(yàn)誤差。由圖中3個(gè)出峰位置觀察可知(A：阿拉伯糖與精氨酸、核糖與精氨酸；B：核糖與賴氨酸、阿拉伯糖與賴氨酸；C：阿拉伯糖與精氨酸、核糖與精氨酸)，MRPs產(chǎn)生的OD值極有可能與反應(yīng)體系中的氨基酸類物質(zhì)有關(guān)，這一猜想需要進(jìn)一步證實(shí)。

2.4 均勻?qū)嶒?yàn)

為了更好地對(duì)比3種儀器測(cè)量MRPs抗氧化活性的準(zhǔn)確性，選取阿拉伯糖與賴氨酸組合，以DPPH自由基(DPPH·)清除率為檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)用酶標(biāo)儀法、ESR法、紫外分光光度計(jì)法對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn)，結(jié)果見表2。

表2 均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果Table 2 Uniform experimental results

ESR法均勻?qū)嶒?yàn)Mathmatics 4.0軟件分析：回歸方程的P值為0.008837，方程可靠；回歸方程為：Y=-31.2045-0.4127X1+12.0035X2-2.5427X3-0.1311X4+0.003888X1X4。

從回歸分析的顯著性分析可以看出，pH值(X2)對(duì)DPPH·清除率具有極顯著的影響，P值為0.00126；反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度有一定的交互影響。

酶標(biāo)儀法均勻?qū)嶒?yàn)Mathmatics 4.0軟件分析：回歸方程的P值為0.035175，方程可靠；回歸方程為：Y=-64.3146+0.1509X1+3.4743X2-5.7622X3+0.4131X4。

從回歸分析的顯著性分析可以看出，反應(yīng)溫度(X4)對(duì)DPPH·清除率具有極顯著的影響，P值為0.0095；反應(yīng)時(shí)間(X1)、pH(X2)和料液比(X3)都不具有顯著影響。

紫外分光光度計(jì)法均勻?qū)嶒?yàn)Mathmatics 4.0軟件分析：回歸方程的P值為0.00793，方程可靠；回歸方程為：Y=124.362+3.186X2X3+0.1083X2X4-19.6154X2-25.0783X3-0.3485X4。

從回歸分析的顯著性分析可以看出，pH(X2)、料液比(X3)以及pH(X2)與料液比(X3)之間的交互影響，pH(X2)與反應(yīng)溫度(X4)之間的交互影響，對(duì)DPPH·清除率具有顯著的影響，P值分別為0.0145，0.020，0.0244，0.02136。

結(jié)合上述均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果以及研究實(shí)際情況得到優(yōu)化水平組合，見表3。

表3 3種方法均勻?qū)嶒?yàn)優(yōu)化水平結(jié)果Table 3 Results of the uniform experimental optimization level of the three methods

由表2可知，紫外法和酶標(biāo)儀法的DPPH·有負(fù)數(shù)存在，即加入MRPs后生成了DPPH·，這顯然不符合實(shí)際情況。且出現(xiàn)負(fù)數(shù)的組多為pH較大的組，這與pH的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，因此pH值越高，越有利于在517 nm處有較強(qiáng)吸光度的反應(yīng)產(chǎn)物生成或者是MRPs中某類物質(zhì)在堿性條件下轉(zhuǎn)化成具有較強(qiáng)吸光度值的物質(zhì)，這一猜想有待于進(jìn)一步研究。

由表3可知，3種方法優(yōu)化的結(jié)果不同，且最優(yōu)條件差異較大。ESR法、酶標(biāo)儀法、紫外法3種方法優(yōu)化結(jié)果的相對(duì)誤差分別為1.95%、504.31%、3.41%。因此從優(yōu)化結(jié)果來看，3種方法的準(zhǔn)確性為ESR法>紫外法>酶標(biāo)儀法。從最優(yōu)條件分析，酶標(biāo)儀法與紫外法優(yōu)化都需要高溫和較長時(shí)間，而ESR法最優(yōu)條件的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間都很合理，因此ESR法優(yōu)于另外兩種方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以阿拉伯糖與賴氨酸為美拉德反應(yīng)模型，運(yùn)用ESR法、紫外分光光度計(jì)法、酶標(biāo)儀法測(cè)量了不同反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、料液比、pH下得到的MRPs對(duì)DPPH·的清除能力大小，通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種方法所測(cè)得的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度的結(jié)果基本保持一致，在酸性條件下3種方法所測(cè)得的結(jié)果也基本一致，但是用3種方法測(cè)得的堿性條件和不同糖和氨基酸比例組的結(jié)果不同。

對(duì)此可以做出以下假設(shè)：美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有抗氧化活性的物質(zhì)是一種復(fù)雜的物質(zhì)。在這類物質(zhì)中有一類物質(zhì)能夠與DPPH結(jié)合，且結(jié)合后的產(chǎn)物在517 nm處具有極強(qiáng)的吸光度信號(hào)，這類物質(zhì)在pH值越大時(shí)生成量也越大，且與糖和氨基酸的比例有關(guān)，因此以吸光度值來衡量MRPs與DPPH反應(yīng)前后濃度變化就會(huì)有很大的誤差，且反應(yīng)后反應(yīng)物的OD值占據(jù)主要變化，因此扣除樣品OD值也不能完全保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在尋找MR最優(yōu)條件時(shí)也會(huì)因?yàn)檫@一誤差而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，因此ESR法更適合于尋找MR最優(yōu)條件以及抗氧化活性的研究。比色法(紫外法、酶標(biāo)儀法)極有可能不適合MRPs最優(yōu)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，而只適用于同一反應(yīng)條件下MRPs抗氧化活性的對(duì)比研究。