趙盛男，張振旺，堯 青，劉 超

(湖北科技學院 1. 醫(yī)學部藥學院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室、3.醫(yī)學部醫(yī)藥研究院，湖北 咸寧 437100)

糖尿病肺纖維化嚴重損害患者身心健康，但目前尚無行之有效的治療，因此，明確其分子機制有重要意義。多項研究表明[1-3]，患者長期處于高糖狀態(tài)會活化成纖維細胞和肌成纖維細胞，增加膠原分泌，而促進膠原降解的基質金屬蛋白酶活性降低、其酶抑制劑表達上調，導致膠原降解減少，最終形成膠原合成增加和沉積，致使肺纖維化的產(chǎn)生[4-5]。而纖維化產(chǎn)生的信號主要是通過 TGF-β/Smads通路傳導的，在刺激作用下，TGF-β1蛋白表達增加，Ⅰ、Ⅱ型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體活化，促進Smad2和Smad3蛋白磷酸化，并與Smad4蛋白形成活性復合體，進入細胞核，上調膠原等纖維化相關基因的表達，從而促進纖維化的形成[6-7]。由此可見，膠原合成增加是糖尿病肺纖維化的基礎，明確高糖誘導膠原合成的分子機制能夠為糖尿病肺纖維化提供新的治療方向。

Fox蛋白家族是真核生物中廣泛存在的一類轉錄因子，主要與糖脂代謝、胚胎發(fā)育、細胞周期調節(jié)等功能有關，其家族中的FOXM1在TGF-β/Smads通路的信號傳導中有重要的調節(jié)作用。研究表明[8-10]，F(xiàn)OXM1以劑量依賴的方式抑制TIF1γ對Smad4的泛素化作用，促進Smad4的穩(wěn)定，并且誘導Smad3磷酸化，維持P-Smad3/Smad4復合物的形成，驅動并加強TGF-β/Smads信號通路的傳導，從而促進膠原合成，減少膠原降解，加劇纖維化發(fā)生。因此，我們推測FOXM1可能是高糖誘導膠原合成及糖尿病肺纖維化發(fā)生過程中的一個相關因子。

本文通過高糖刺激MRC-5細胞模擬糖尿病誘導的肺纖維化模型，探討高糖誘導膠原合成的機制及FOXM1在高糖誘導膠原合成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料MRC-5為人胚肺成纖維細胞，MRC-5細胞及其專用MEM培養(yǎng)基均購于武漢普諾賽生命科技有限公司；Glucose、DMSO和Mannitol均購于Sigma公司；Thiostrepton購于MedChemExpress生物科技公司；COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGF-β1、α-SMA、Fibronectin、MMP9、TIMP1、FOXM1、P-Smad2、Smad2和α-Tubulin抗體均購于ABclonal公司；HRP標記二抗購于biosharp公司；逆轉錄試劑盒和qPCR試劑盒均購于ABclonal公司；ECL試劑盒和CCK8試劑盒均購于大連美侖生物技術有限公司；DEPC水購于碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器超凈工作臺(蘇州凈化公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；全波段多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；垂直電泳儀、電轉移槽和自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)等。

1.3 方法

1.3.1CCK8檢測增殖活性 (1)檢測不同時間點高糖對MRC-5細胞增殖活性的影響：選擇第3～5代處于對數(shù)生長期的MRC-5細胞接種至96孔板，24 h后換無血清培養(yǎng)基饑餓細胞過夜，按預設時間點72、48、24、12、6 h給予30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)細胞，每組8個復孔，最后一起給予每孔10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)細胞30 min后，在450 nm波長下用酶標儀檢測細胞活性。(2)檢測不同濃度葡萄糖對MRC-5細胞增殖活性的影響：選擇第3～5代處于對數(shù)生長期的MRC-5細胞接種至96孔板，24 h后換無血清培養(yǎng)基饑餓細胞過夜，分別給予30 mmol·L-1甘露醇及5.5、15、30、45 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)細胞，每組8個復孔，24 h后給予每孔10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)細胞30 min后，在450 nm波長下用酶標儀檢測細胞活性。

1.3.2細胞培養(yǎng)及分組 將第3～5代處于對數(shù)生長期的MRC-5細胞于含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗的MEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。細胞長滿后，傳代接種于6孔板中，MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至70%～80%時，換無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再給予不同的無血清含藥培養(yǎng)基，將細胞分為以下4組：CON組(正常對照)、HM組(30 mmol·L-1甘露醇高滲對照)、HG組(30 mmol·L-1高糖)、HG+TST組(30 mmol·L-1高糖+1 μmol硫鏈絲菌素)[11]，培養(yǎng)細胞24 h后，收細胞用于后續(xù)的Western blot和qPCR檢測。

1.3.3Western blot法檢測膠原合成相關因子的表達水平 細胞給藥完成后，提取蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，調整濃度一致后變性，-20 ℃保存；常規(guī)Western blot法檢測相關蛋白的表達情況：根據(jù)蛋白濃度調節(jié)上樣量至25 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳后，250 mA，160 min轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h，分別孵育對應的一抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌4次/10 min，室溫搖床孵育相應的HRP標記二抗1 h，TBST洗滌3次/10 min，加入ECL顯影液顯影成像。

1.3.4qPCR法檢測膠原合成相關因子的表達水平 細胞給藥完成后，常規(guī)TRIzol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA后用熒光定量PCR試劑盒將各組細胞的cDNA進行qPCR反應，具體引物信息見Tab 1，以GAPDH作內參，最終以2-ΔΔCt計算膠原合成相關目的基因的mRNA表達水平變化。

Tab 1 Primers involved in Real-time quantitative PCR

2 結果

2.1 MRC-5細胞高糖模型建立高糖(30 mmol·L-1)誘導培養(yǎng)MRC-5細胞，在不同時間檢測細胞活性。結果如Fig 1A所示：高糖誘導培養(yǎng)MRC-5細胞24、48、72 h時，與CON組比，細胞增殖活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，因此選擇24 h作為高糖作用時間；由于培養(yǎng)基中葡萄糖濃度高于正常的5.5 mmol·L-1時，細胞會相應的出現(xiàn)滲透壓改變，達到一定程度時對細胞活性有影響，因此在設置不同濃度梯度的葡萄糖誘導MRC-5細胞時，多設置了一個高滲對照HM組，結果如Fig 1B所示：與CON組比，HG的高滲對照HM組細胞增殖活性無顯著變化(P>0.05)，而葡萄糖濃度在30和45 mmol·L-1時，細胞活性較CON和HM組均有明顯下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，選擇高糖誘導模型建立的條件是30 mmol·L-1培養(yǎng)細胞24 h。

Fig 1 MRC-5 cell activities at different time points and different glucose concentrations detected by n=8)A: The MRC-5 cell activities in different time gradients cultured by high glucose. B: The MRC-5 cell activities in different glucose concentrations or 30 mmol·L-1 mannitol after 24 h. *P<0.05, **P<0.01 vs CON; △P<0.05 vs HM

2.2 高糖促進MRC-5膠原合成高糖(30 mmol·L-1)誘導培養(yǎng)MRC-5細胞，通過Western blot和PCR檢測膠原合成相關因子的表達，結果如Fig 2所示：與CON相比，HG的高滲對照HM組對膠原合成相關因子的表達水平?jīng)]有影響；HG能促進COL Ⅰ、COL Ⅲ、Fn、α-SMA、TGF-β1、P-Smad2和TIMP1的蛋白和mRNA表達，且降低MMP9的蛋白和mRNA表達，導致MMP9/TIMP1比值較CON組降低。

Fig 2 Collagen synthesis in MRC-5 cells induced by high glucose detected by Western blot and n=3)A-D: Western blot band graphs and corresponding results statistics of COL Ⅰ, COL Ⅲ, TGF-β1, P-Smad2, MMP9, TIMP1 and Fn, α-SMA; E-H:Col Ⅰ, Col Ⅲ, TGF-β1, MMP9, TIMP1 and Vim statistical graphs of qPCR results. *P<0.05 vs CON.

2.3 FOXM1在高糖誘導MRC-5細胞中高表達高糖(30 mmol·L-1)誘導培養(yǎng)MRC-5細胞，通過Western blot和PCR檢測FOXM1的表達，結果如Fig 3所示，F(xiàn)OXM1蛋白在HG組的表達遠較CON組高，其mRNA水平也有升高，而HG的高滲對照HM組與CON組相比沒有明顯差別。

Fig 3 The expression level of FOXM1 in MRC-5 cells induced by high glucose detected by Western blot and n=3)A: Western blot band and statistical diagram of FOXM1; B: FOXM1 qPCR statistical diagram. *P<0.05 vs CON.

2.4 抑制FOXM1降低高糖誘導MRC-5細胞膠原合成通過Western blot和qPCR檢測各組膠原合成相關因子的表達，結果如Fig 4所示：與CON組相比，HG促進FOXM1的表達，但給予FOXM1抑制劑TST(HG+TST)干預后，F(xiàn)OXM1表達明顯比單純HG組減少(Fig 4A，F(xiàn))；同時，TST抑制了高糖對MRC-5膠原合成相關因子如COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGF-β1、TIMP1和Fn、α-SMA的蛋白和mRNA誘導作用(Fig 4B-E；Fig 4G-I)，TST還促進HG刺激后MMP9蛋白和mRNA的表達，導致MMP9/TIMP1比值較HG組增加；HG的高滲對照HM組對MRC-5膠原合成相關因子的蛋白及mRNA表達水平與CON組比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Fig 4 Expression of FOXM1 and collagen synthesis in MRC-5 cells induced by high glucose by Western blot and n=3)A: FOXM1 Western blot strip diagram and statistical diagram; B-E: COL Ⅰ, COL Ⅲ, TGF-β1, P-Smad2, MMP9, TIMP1 and Fn , α-SMA Western blot strip diagrams and corresponding results statistics; F: FOXM1 statistical graph of qPCR result; G-I: Col Ⅰ, Col Ⅲ, TGF-β1, MMP9, TIMP1 and Vim′s qPCR statistical graphs. *P<0.05 vs CON； #P<0.05 vs HG.

3 討論

糖尿病患者長期處于高糖狀態(tài)會加速膠原等細胞外基質的合成，誘導上皮間質轉化，促進纖維化的發(fā)生發(fā)展，而纖維化的激素治療會影響糖代謝甚至引起糖代謝紊亂，加重糖尿病的發(fā)展，說明高糖與纖維化相互影響[12-13]。纖維化的發(fā)生往往是細胞外基質如膠原等合成增多所致，主要由TGF-β/Smads信號通路調節(jié)，在這個傳導過程中，F(xiàn)OXM1具有重要的調節(jié)作用[14-15]，且被證實參與心肌膠原合成及其纖維化的發(fā)生發(fā)展[16]，但其在糖尿病肺纖維化中的作用還未見報道，因此本研究通過高糖培養(yǎng)MRC-5細胞模擬高糖誘導肺纖維化的過程，在細胞水平上探討高糖對肺細胞膠原合成的影響及FOXM1在其中的作用。

本研究顯示，30 mmol·L-1高糖誘導培養(yǎng)MRC-5細胞24 h時，細胞活性與CON組相比明顯下降，而HG的高滲對照HM組與CON組相比則無顯著變化，可見HG組細胞增殖活性的下降不是由其高滲透壓引起的，而是葡萄糖的作用所致，HG模型可靠。高糖促進MRC-5細胞中膠原合成和TGF-β/Smads信號通路相關因子COL Ⅰ、COL Ⅲ、Fn、α-SMA、TGF-β1、p-Smad2和TIMP1的蛋白和mRNA表達，卻降低了降解膠原的MMP9蛋白及mRNA表達，而高滲對照HM組對上述相關因子的表達水平均未發(fā)現(xiàn)有顯著性改變，可見高糖可以促進MRC-5細胞膠原合成，減少膠原降解，誘導肺纖維化相關因子的表達，且其作用與高糖產(chǎn)生的滲透壓內環(huán)境無關，而是由其高葡萄糖作用所致。另外，我們發(fā)現(xiàn)高糖誘導下FOXM1的表達水平增加，為進一步探討FOXM1的作用，我們在高糖培養(yǎng)的MRC-5細胞中加入FOXM1的抑制劑硫鏈絲菌素共培養(yǎng)細胞，結果顯示FOXM1表達較單獨的HG組明顯有被抑制，且其參與的TGF-β/Smads信號通路相關因子表達明顯下調，膠原合成相關因子也均較HG組有不同程度的改變，這與Penke等[17]證實的FOXM1是肺纖維化的一個關鍵驅動因子研究結果是一致的。而Girish等[18]報導的糖尿病肺纖維化是通過激活TGF-β/Smads信號通路所致，F(xiàn)OXM1又可以驅動并加強TGF-β/Smads信號通路的傳導[7-8]。因此，我們有理由認為FOXM1是高糖誘導膠原合成過程的一個相關調節(jié)因子，且其發(fā)揮作用的機理和TGF-β信號通路有關。

綜上所述，本研究通過設立高糖的高滲對照，建立高糖模型，并對細胞給予硫鏈絲菌素處理，檢測高糖狀態(tài)下COL Ⅰ、COL Ⅲ等膠原合成因子的表達及FOXM1的表達，證實了高糖會通過TGF-β/Smads通路促進膠原合成且加劇肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)OXM1是參與其中的一個相關調節(jié)因子。本研究為進一步了解高糖誘導膠原合成以及糖尿病肺纖維化的機制提供了依據(jù)，為防治糖尿病肺纖維化提供了新思路，但本實驗只涉及了體外細胞實驗，對于FOXM1在高糖誘導膠原合成及纖維化中的作用還應輔以分子生物學、動物模型實驗等加以深入研究。