高 輝，劉 恭，韓仙菊

(石家莊市婦幼保健院藥劑科，河北 石家莊 050011)

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，通常出現(xiàn)廣泛而多變的可逆性呼氣氣流受限，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和咳嗽等癥狀[1]。支氣管哮喘多在夜間或清晨發(fā)作，若診治不及時(shí)，隨病程的延長可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑[2-3]。常規(guī)的西藥治療很難從根本上解決問題，并且容易反復(fù)，會(huì)增加繼續(xù)治療的難度，中醫(yī)治療標(biāo)本兼顧，辨證論治，安全性和療效均較好。中醫(yī)治療哮喘遵“急則治其標(biāo)”“緩則治其本”原則，慢性期以益氣化痰、降氣平喘為主。黃芩素是黃芩中含量較高的黃酮類化合物之一，黃芩素能夠緩解氣管過敏性收縮及整體過敏性氣喘，具有較廣的抗菌譜，對(duì)多種細(xì)菌均有抑制作用[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-625-5p可以調(diào)控肺部疾病的進(jìn)程，miR-625-5p通過靶向調(diào)控PRKACA促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。LncRNA MIR503HG通過miR-625-5p參與肺癌細(xì)胞的增殖與凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)主要探討黃芩素調(diào)控miR-625-5p表達(dá)對(duì)支氣管哮喘小鼠ASMCs細(xì)胞增殖、遷移及炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：ASMCs細(xì)胞購自中國細(xì)胞資源庫。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：重組小鼠血小板衍生生長因子(PDGF)購自蘇州派普泰克生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gbico公司；Lipofectamine 2000購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒購自北京優(yōu)尼康生物科技公司；Transwell小室購于北京賽因百奧生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自大連寶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物：黃芩素(批號(hào)DH0024)購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度>98%。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組[8]：ASMCs細(xì)胞復(fù)蘇后，接種到含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5%CO2。將ASMCs細(xì)胞分為對(duì)照組、PDGF組和黃芩素低、中、高劑量組。對(duì)照組未予干預(yù)措施；PDGF組使用PDGF誘導(dǎo)ASMCs增殖；黃芩素低、中、高劑量組分別采用10、20、40 μmol/L黃芩素處理。將miR-NC、miR-625-5p轉(zhuǎn)染至PDGF誘導(dǎo)ASMCs細(xì)胞，作為PDGF+miR-NC、PDGF+miR-625-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-625-5p轉(zhuǎn)染至PDGF誘導(dǎo)ASMCs細(xì)胞，以40 μmol/L的黃芩素處理，作為PDGF+anti-miR-NC+40 μmol/L組、PDGF+anti-miR-625-5p+40 μmol/L組。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖[9]：取各組細(xì)胞接種于96孔板，1×103個(gè)/孔，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8溶液，10 μl/孔，繼續(xù)孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(OD)值。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移[9]：取各組細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/ml)，Transwell小室的上室中每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，Transwell小室的下室每孔加入600 μl含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌后采用多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，置于顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移率=(0 h遷移細(xì)胞數(shù)量-48 h遷移細(xì)胞數(shù)量)/0 h遷移細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞IL-4、IL-6、IL-8水平[10]：提取細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測細(xì)胞IL-4、IL-6、IL-8水平，實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 RT-qPCR檢測細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)水平[8]：采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，RNA樣品的純度通過紫外分光光度計(jì)測量。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為目的基因進(jìn)行RT-qPCR。以U6為內(nèi)參，通過2-△△Ct公式計(jì)算miR-625-5p相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：miR-625-5p上游引物：5’-CGCGAGGGGGAAAGTTCTA-3’，下游引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖、遷移的影響 與對(duì)照組比較，PDGF組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移率顯著升高(P<0.05)；與PDGF組比較，黃芩素低、中、高劑量組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖、遷移的影響(%)

2.2 黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞IL-4、IL-6、IL-8水平的影響 與對(duì)照組比較，PDGF組IL-4、IL-6、IL-8水平顯著升高(P<0.05)；與PDGF組比較，黃芩素低、中、高劑量組IL-4、IL-6、IL-8水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3 黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，PDGF組細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與PDGF組比較，黃芩素低、中、高劑量組細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)的影響

2.4 過表達(dá)miR-625-5p對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖、遷移及炎性因子的影響 與PDGF+miR-NC組比較，PDGF+miR-625-5p組細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移率、IL-4、IL-6、IL-8水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 過表達(dá)miR-625-5p對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖、遷移及炎性因子的影響

2.5 抑制miR-625-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及炎性因子的影響 與PDGF+anti-miR-NC+40 μmol/L組比較，PDGF+anti-miR-625-5p+40 μmol/L組細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖率和細(xì)胞遷移率、IL-4、IL-6、IL-8顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 抑制miR-625-5p逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)ASMCs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及炎性因子的影響

3 討 論

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥，以反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或者咳嗽為主要臨床癥狀[1]。遺傳和環(huán)境是導(dǎo)致哮喘發(fā)作的主要因素，哮喘難以根治，所以應(yīng)該及時(shí)預(yù)防和治療[11-12]。

黃芩是唇形科黃芩屬多年生草本植物，臨床抗菌性比較好[13-15]，而且不易產(chǎn)生抗藥性。黃芩素是黃芩中含量較高的化合物，用于治療肺部疾病具有較好的療效[16-17]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，PDGF組細(xì)胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平顯著升高；與PDGF組比較，黃芩素顯著降低增殖率、遷移率以及炎性因子水平。有研究證實(shí)，黃芩素通過抑制JAK/STAT通路降低哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[18]。漢黃芩素通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡改善重癥哮喘患者癥狀，緩解病情[19]。黃芪湯加減可以通過降低患者炎癥反應(yīng)水平，改善慢性阻塞性肺疾病急性加重期動(dòng)脈血?dú)夂头喂δ躘20-21]。以上研究結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與PDGF組比較，黃芩素顯著上調(diào)細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)；與PDGF+miR-NC組比較，PDGF+miR-625-5p組細(xì)胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平顯著降低。miR-625-5p在卵清蛋白誘導(dǎo)的支氣管哮喘小鼠中表達(dá)顯著下調(diào)，抑制miR-625-5p有助于減輕哮喘癥狀[22]。miR-625-5p靶向Akt2負(fù)調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[23]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，與PDGF+anti-miR-NC+40 μmol/L組比較，PDGF+anti-miR-625-5p+40 μmol/L組細(xì)胞miR-625-5p表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平顯著升高。說明抑制miR-625-5p可逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)支氣管哮喘小鼠ASMCs細(xì)胞增殖、遷移及炎性因子的作用。既往多項(xiàng)研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。研究表明，黃芩素通過miR-424-3p/PTEN/PI3K/AKT通路抑制非小細(xì)胞肺癌增殖，增強(qiáng)順鉑敏感性[24]。黃芩素通過調(diào)控miRNA-135b-3p靶向SIX4抑制A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[25]。

綜上所述，黃芩素通過上調(diào)miR-625-5p表達(dá)抑制支氣管哮喘小鼠的細(xì)胞增殖率、遷移率以及炎性因子水平。