陳天帷，李志剛，王 彬，畢煥洲，李海松，于珊珊，葉雯佳

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518172)

不育癥是指育齡男女同居1年未避孕，有正常性生活而未孕[1]。少弱精子癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一[2-3]。長期電磁輻射環(huán)境的暴露被認(rèn)為是精子質(zhì)量下降的原因之一[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對少弱精子癥尚無特效藥，治療藥物主要以他莫昔芬、氯米芬、胰激肽原酶、左卡尼汀、維生素E為主[5]。畢煥洲等[6]通過長期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，海龍、黃精兩味中藥按照1∶1比例組成海龍黃精散，治療微波輻射引起的男性不育癥有顯著療效。研究表明，炎癥反應(yīng)可上調(diào)精漿白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子水平，且與精子數(shù)量減少、進(jìn)行性精子活動能力下降有關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)以微波輻射誘導(dǎo)少弱精子小鼠為模型，以TNF-α、IL-6、白介素-12(IL-12)為觀察指標(biāo)，探討海龍黃精散干預(yù)少弱精子癥的作用機(jī)制，為海龍黃精散治療少弱精子癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組：選用SPF級7周齡BALB/c雄性小鼠40只，動物購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(粵)2018-002。將小鼠飼養(yǎng)于深圳市耳鼻咽喉研究所實(shí)驗(yàn)室，室溫(24±1)℃，濕度(50±5)%，12 h明暗交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。遵循《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》[8]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：海龍、黃精由北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院中藥房提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：微波治療儀(KJ-6200B型，徐州市萬諾醫(yī)療設(shè)備有限公司)，微波泄露檢測儀(HI-1501型，美國ETSLindgren公司)，生物倒置顯微鏡(BX43型，日本Olympus公司)，數(shù)字病理切片掃描儀(VS200型，日本Olympus)，多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M3型，美國Molecular Devices公司)。TNF-α ELISA kit(批號 KGEMC102a，凱基生物)，IL-1 ELISA kit(批號 EK1176)，IL-6 ELISA kit(批號 EK1222)，IL-12 ELISA kit(批號 EK14746)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組與給藥：將40只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，分為空白組、模型組及海龍黃精散小、中、大劑量組，每組8只，除空白組外，其余四組進(jìn)行微波輻射造模。參照文獻(xiàn)[9]建立微波輻射不育癥模型，將小鼠置于透明亞克力缸中，暴露在頻率為2450 MHz連續(xù)微波，功率密度為40 mW/cm2，輻射18 d，每天1 h。模型組：造模同時灌胃0.9%氯化鈉溶液0.1 ml。空白組：置于微波燈下但未予輻射，灌胃0.9%氯化鈉溶液0.1 ml。海龍黃精散給藥劑量：小鼠按生藥0.6 g/kg劑量每日灌胃1次，每次灌食藥液0.1 ml。8周齡BALB/c雄性小鼠體重約25 g，經(jīng)計(jì)算海龍黃精散劑量應(yīng)為0.015 g，與0.1 ml的0.9%氯化鈉溶液混勻后灌胃。海龍黃精散小劑量組(0.3 g/kg)：造模同時灌胃小劑量海龍黃精散藥液0.1 ml；海龍黃精散中劑量組(0.6 g/kg)：造模同時灌胃中劑量海龍黃精散藥液0.1 ml；海龍黃精散大劑量組(1.2 g/kg)：造模同時灌胃大劑量海龍黃精散藥液0.1 ml。五組小鼠均連續(xù)灌胃18 d，1次/d。

1.2.2 小鼠精子參數(shù)比較：用頸椎脫臼法處死小鼠，立即將各組小鼠兩側(cè)附睪和附睪管剖開，用0.1 ml的0.9%氯化鈉溶液沖洗后，滴液于精子計(jì)數(shù)板Makler上，檢測精子濃度；應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助分析檢測精子活力，包括前向運(yùn)動精子(PR)、非前向運(yùn)動精子(NP)，精子總活力=PR+NP。

1.2.3 小鼠睪丸組織病理學(xué)形態(tài)觀察及Johnson評分評估：取小鼠雙側(cè)睪丸，右側(cè)置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，將睪丸切成厚度為4 μm的石蠟切片，蘇木-伊紅(HE)染色后鏡下觀察生精小管內(nèi)生精細(xì)胞(精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子)、支持細(xì)胞損傷情況。并采用Johnson評分法[10]評價精子發(fā)生障礙程度：生精功能正常為10分；各期生精細(xì)胞存在，但排列紊亂為9分；生精小管中有少量精子(5～10個)為8分；無精子，但有許多精子細(xì)胞為7分；無精子，僅有少量精子細(xì)胞(5～10個)為6分；無精子細(xì)胞，但有許多精母細(xì)胞5分；無精子，僅有個別精母細(xì)胞(<5個)為4分；僅有精原細(xì)胞為3分；無生精細(xì)胞，僅有支持細(xì)胞為2分；管腔內(nèi)無細(xì)胞為1分。評分越高，精子發(fā)生越好，反之精子發(fā)生障礙程度越嚴(yán)重。

1.2.4 小鼠睪丸組織IL-6、IL-12、TNF-α水平檢測：濾紙吸干左側(cè)睪丸組織水分，用電子天平稱重后剪碎，按1∶99添加0.9%氯化鈉溶液，超聲粉碎制備1%的組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液，采用ELISA法分別檢測組織IL-6、IL-12、TNF-α水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠精液參數(shù)比較 見表1。干預(yù)后，模型組小鼠精液PR、NP、精子總活力均較空白組降低(P<0.05)，海龍黃精散小劑量組小鼠NP較模型組升高(P<0.05)，海龍黃精散中、大劑量組小鼠PR、NP、精子總活力均較模型組升高(P<0.05)。

表1 各組小鼠精液參數(shù)比較(%)

2.2 各組小鼠睪丸生精小管組織病理學(xué)觀察 空白組小鼠生精小管厚度適中，細(xì)胞排列較整齊，管腔無明顯增大，可見各級生精細(xì)胞和精子，支持細(xì)胞排列整齊。模型組小鼠生精小管變薄，細(xì)胞排列松散，管腔增大，生精細(xì)胞和精子數(shù)量減少，甚至各級生精細(xì)胞大部分消失，支持細(xì)胞部分缺失。海龍黃精散小劑量組小鼠生精小管變薄，細(xì)胞排列松散，管腔增大，生精細(xì)胞和精子數(shù)量減少，支持細(xì)胞少部分缺失，較模型組稍改善。海龍黃精散中劑量組小鼠生精小管變薄，細(xì)胞排列松散，管腔稍增大，生精細(xì)胞和精子數(shù)量減少，支持細(xì)胞排列尚整齊。海龍黃精散大劑量組小鼠生精小管變薄好轉(zhuǎn)，細(xì)胞排列稍松散，支持細(xì)胞排列尚整齊，管腔無明顯增大，生精細(xì)胞和精子數(shù)量稍減少(圖1)。

圖1 各組小鼠睪丸生精小管組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×400)

2.3 各組小鼠生精小管Johnson評分比較 見表2。與空白組比較，模型組小鼠Johnson評分下降(P<0.05)；與模型組比較，海龍黃精散小、中、大劑量組小鼠Johnson評分均升高(P<0.05)。

表2 各組小鼠生精小管Johnson評分比較(分)

2.4 各組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6、IL-12水平比較 見表3。與空白組比較，模型組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6、IL-12水平升高(P<0.05)；與模型組比較，海龍黃精散小、中、大劑量組小鼠TNF-α、IL-12水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，海龍黃精散中、大劑量組小鼠IL-6水平降低(P<0.05)。

表3 各組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6、IL-12水平比較(pg/ml)

3 討 論

少弱精子癥屬中醫(yī)學(xué)“無子”“艱嗣”“精冷”“精少”等范疇[11]?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩疲骸澳凶佣四I氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子”，認(rèn)為腎中精氣與男子生殖功能密切相關(guān)，若是精虧氣少則難以有子。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，少弱精子是近年來男性不育癥較為常見的病因之一[12]。其中腎虛精虧證是少弱精子癥最常見的中醫(yī)證型[13]。睪丸是微波輻射的靶器官之一，微波輻射可以造成睪丸損傷[14]。本研究使用頻率為2450 MHz的連續(xù)微波，功率密度為40 mW/cm2，建立少弱精子癥小鼠模型，探討海龍黃精散對少弱精子癥的作用機(jī)制。

中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，主生殖。腎主封藏，具有攝納、貯存、閉藏精氣的功能[15]。腎中所藏精氣之來源，一是稟受于父母的生殖之精，二是從食物中攝取的營養(yǎng)成分和臟腑生理活動過程中化生的精微物質(zhì)。腎為藏精之本，精氣藏于腎，促進(jìn)腎中精氣的不斷充盈，防止精氣無故流失，為精氣在體內(nèi)充分發(fā)揮其生理功能創(chuàng)造必要條件[16]。腎精不足可由先天稟賦不足或五勞七傷等引起，腎精虧虛、命門火衰，亦可因后天脾胃虛寒，化源不足，致腎精不充。海龍黃精散由海龍和黃精兩味中藥組成。海龍，入腎、肝兩經(jīng)，補(bǔ)腎壯陽，補(bǔ)先天之精；黃精，入肺、脾、腎經(jīng)，補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾潤肺、益腎氣，先后天同補(bǔ)。兩藥同用，陰陽調(diào)和，以后天之精補(bǔ)先天之精，共同發(fā)揮補(bǔ)腎填精的功效，治療男性不育效果顯著。

高雅靜等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高功率微波輻射可致大鼠精子總量、密度和活動率均下降，補(bǔ)腎生精中藥干預(yù)后，以上指標(biāo)得到改善。本研究顯示，微波輻射后小鼠生精小管結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，生精小管變薄，細(xì)胞排列松散，管腔增大，生精細(xì)胞和精子數(shù)量減少，甚至出現(xiàn)各級生精細(xì)胞大部分消失，Sertoli細(xì)胞部分缺失。海龍黃精散干預(yù)后，生精小管細(xì)胞得到改善，精子活率提升。提示微波輻射可能損害小鼠精子發(fā)生睪丸微環(huán)境中的Sertoli細(xì)胞，海龍黃精散可逆轉(zhuǎn)微波輻射對小鼠生精細(xì)胞的損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6和IL-12水平均高于空白組，中、大劑量海龍黃精散組小鼠睪丸組織TNF-α、IL-6和IL-12水平均低于模型組，提示微波輻射可增加小鼠睪丸組織促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，海龍黃精散可抑制微波輻射引起的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子是具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答功能的機(jī)體蛋白質(zhì)活性產(chǎn)物，作用于睪丸的生精微環(huán)境，對精子的產(chǎn)生、成熟、獲能、運(yùn)動等方面有著重要的生理作用[18]。TLR是“模式識別受體”，可以識別高度保守的病原體相關(guān)分子模式[19]。TLR配體的激活可以觸發(fā)一個共同的信號通路，從而上調(diào)IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。睪丸內(nèi)曲細(xì)精管的Sertoli細(xì)胞是生精微環(huán)境的重要組成部分，能為精子生成的提供免疫網(wǎng)絡(luò)，維持生精功能的正常運(yùn)行[20]。Wu等[21]研究表明，微波輻射誘導(dǎo)Sertoli細(xì)胞中TLRs信號通路的激活，上調(diào)細(xì)胞因子IL-6、IL-12和TNF-α表達(dá)，進(jìn)而影響精子形成，本研究結(jié)果與其一致。Jin等[22]實(shí)驗(yàn)表明小鼠精子質(zhì)量的下降可能是由于二噁英通過Klotho/PDLIM2/p65途徑影響支持細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子和IL-12分泌，從而促進(jìn)睪丸炎癥反應(yīng)，影響睪丸微環(huán)境并誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡。

綜上所述，海龍黃精散可以提高少弱精子癥小鼠精液質(zhì)量，升高Johnson評分，降低睪丸TNF-α、IL-6、IL-12水平。本研究為海龍黃精散治療男性少弱精子癥提供了理論基礎(chǔ)。