吳中艷，覃 杰

（1.新疆生產建設兵團第二師37團農發(fā)中心，新疆 且末 841900；2.新疆生產建設兵團第二師畜牧獸醫(yī)站，新疆 鐵門關 841005）

犢牛大腸桿菌病是由大腸桿菌引起的以犢牛腹瀉和敗血癥為主要癥狀的一種細菌性疾病[1]。沙門氏菌病，又名副傷寒，臨床多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎，也可使懷孕母畜發(fā)生流產。目前主要采用抗生素對其進行防治。然而抗生素的大量使用會出現(xiàn)耐藥性和藥物殘留問題。大腸桿菌、沙門氏菌血清型眾多不同地區(qū)血清型差異較大。本試驗系從腹瀉牛中分離鑒定出當?shù)氐膬?yōu)勢血清型，制備成二聯(lián)四價氫氧化鋁佐劑滅活疫苗，經臨床試驗，此疫苗免疫原性和安全性良好。

1 材料

1.1 病料

分離鑒定出O78和O111血清型大腸桿菌、都柏林沙門氏菌以及鼠傷寒沙門氏菌。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、LB肉湯，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 實驗動物

昆明系小白鼠來自石河子大學實驗動物中心，試驗牛來自鐵門關市30團和31團牛場。

2 方法

2.1 大腸桿菌、沙門氏菌懸液的制備與滅活

將4種菌株分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，挑取培養(yǎng)物接種于LB肉湯培養(yǎng)，制取種子液[2-3]。將種子液增菌并稀釋細菌濃度至1014個／mL。將4種菌液按照1∶1∶1∶1比例等體積混合，向菌液中加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，滅活24 h。將菌液接種于營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基，檢測細菌活力。將收集到的滅活菌液以12 000r/min的離心速度離心5 min，棄去上清液。在超凈工作臺上將菌體用少量生理鹽水稀釋攪拌后倒入80目銅篩過濾到小瓶內，加入生理鹽水，配制成含菌量為3×1010個／mL的菌液。

2.2 滅活疫苗的制備

用硫酸鋁和氫氧化鈉，配制成氫氧化鋁佐劑原液，按1∶4的比例與生理鹽水混合，配制成佐劑。按菌液量的1/3加入佐劑，充分混合，制成二聯(lián)四價滅活疫苗。成年牛注射劑量為6 mL每頭份，犢牛用量減半。

2.3 滅活疫苗的質量檢驗

無菌檢驗。將滅活疫苗0.2 mL分別接種于營養(yǎng)瓊脂和麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察有無細菌生長。

安全性試驗。取10只昆明系小白鼠（公母各半）分別于頸部皮下注射滅活疫苗0.1 mL，觀察采食和精神狀況，以及注射部位情況和死亡情況。選取15日齡、60日齡、200日齡和2歲健康牛各10頭，分別于頸部皮下注射疫苗6 mL（2歲牛12 mL），連續(xù)15 d觀察試驗牛的注射部位情況和精神、采食以及發(fā)病狀況。

2.4 疫苗效力檢驗

選取20只成年小白鼠隨機分成2組，試驗組10只 （首免后14 d加強免疫1次）皮下注射疫苗0.1 mL/只，對照組注射生理鹽水，42 d后給試驗組和對照組用分離培養(yǎng)的O78和O111血清型大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌混合菌液0.5 mL于皮下注射攻毒，7 d后觀察小白鼠的采食、精神、存活和死亡狀況，如出現(xiàn)死亡，則對其進行細菌分離培養(yǎng)鑒定。

2.5 滅活疫苗免疫效果觀察和攻毒試驗

分組并采用皮下注射方法。A組15頭（1日齡首免，14日齡加強免疫1次），B組15頭 （1日齡首免，21日齡加強免疫1次）,C組15頭 （60日齡首免，81日齡加強免疫1次），D組為對照組20頭 （1日齡牛、60日齡牛各10頭，注射生理鹽水）。

血清抗體效價檢測?？乖苽?。濃度為30億/mL的O78大腸桿菌、O111大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌菌液50 mL，經高壓滅菌破壞其菌毛抗原后作為抗原診斷液。采用玻片凝集試驗方法，取100μL血清用生理鹽水從1∶2開始做倍比稀釋直到1∶256，然后取稀釋血清50μL與50μL抗原等體積混合，攪拌均勻，觀察其凝集現(xiàn)象。攻毒保護試驗。將濃度為30億／mL的O78大腸桿菌、O111大腸桿菌、都柏林沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等體積混合，取6 mL分別在首免42 d后給A、B、C、D組試驗牛皮下注射，連續(xù)20 d觀察試驗牛的采食、精神及發(fā)病狀況。對出現(xiàn)臨床癥狀的牛使用頭孢哌酮、頭孢噻呋鈉或氧氟沙星進行治療。

3 結果與分析

3.1 滅活疫苗的質量檢驗

無菌檢查結果。經甲醛滅活后的4種細菌混合懸液在營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)均無菌落生長，說明滅活效果良好。將疫苗接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂平板上均無菌落生長，說明滅活效果良好。

安全性試驗結果。小白鼠經注射疫苗后，除2只出現(xiàn)一過性精神萎靡和食欲下降外，其他小白鼠均未見不良反應。所有試驗牛的注射部位未見紅腫、化膿等異?，F(xiàn)象，采食及精神狀況正常，表明疫苗具有較高的安全性。

3.2 疫苗效力檢驗結果

試驗組小白鼠精神、食欲正常，無死亡。對照組所有的小白鼠無精神萎靡和食欲不振癥狀，死亡8只，死亡率為80%。

3.3 滅活疫苗的免疫保護效果

由表1可知，首免7 d后免疫組 （A，B，C組）的O78血清型大腸桿菌血清凝集抗體水平為1∶2～1∶32，首免后14 d的抗體合格率為40%～60%，首免后21 d的抗體合格率為66.6%～80%。二次免疫后抗體效價提高，首免后42 d的抗體水平達到最高峰，抗體合格率為100%。免疫后180 d的抗體合格率為86.6%～100%。而對照組血清抗體水平始終處于1∶2以下。免疫組（A、B、C組）抗體效價無明顯差異。

表1 O78血清型大腸桿菌凝集抗體水平測定結果

由表2可知，首免 7 d 后，免疫組（A、B、C 組）的O111 大腸桿菌血清凝集抗體水平為 1∶2～1∶32， 首免14 d后的抗體合格率為33.3%～46.6%，首免后21 d的抗體合格率為53.3%～73.3%。二次免疫后抗體效價提高，首免后42 d的抗體水平達到最高峰，抗體合格率為100%。首免后180 d的抗體合格率為86.6%～100%。而對照組血清的抗體水平始終處于1∶2以下。免疫組之間抗體效價無明顯差異。

表2 O111大腸桿菌凝集抗體水平測定結果

由表3可知，首免7 d后免疫組（A、B、C組）的都柏林沙門氏菌血清凝集抗體水平為1∶2～1∶32，首免14 d后的抗體合格率為33.3%～53.3%，首免后21 d的抗體合格率為53.3%～80%。二次免疫后抗體效價提高，首免后42 d的抗體水平達到最高峰，抗體合格率為93.3%～100%。首免后180 d的抗體合格率為80.0%～100%。而對照組血清抗體水平始終處于1∶2以下。免疫組抗體效價無明顯差異。

表3 都柏林沙門氏菌凝集抗體水平測定結果

由表4可知，首免后7 d免疫組（A、B、C組）的鼠傷寒沙門氏菌血清凝集抗體水平為 1∶2～1∶32，首免后14 d的抗體合格率為40.0%～66.6%，首免后21 d的抗體合格率為60%～80%。二次免疫后的抗體效價提高，首免后42 d的抗體水平達到最高峰，抗體合格率為93.3%～100%。首免后180 d的抗體合格率為80.0%～93.3%。而對照組的血清抗體水平始終處于1∶2以下。免疫組抗體效價無明顯差異。

表4 鼠傷寒沙門氏菌凝集抗體水平測定結果

3.4 攻毒保護試驗

免疫組牛的采食和精神狀況良好，存活率達到100%。對照組牛從攻毒后第2天起陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、無食欲、腹瀉，從其糞便中分離到相關細菌。使用頭孢哌酮+氧氟沙星治療后痊愈。

4 討論

大腸桿菌和沙門氏菌的血清型眾多，且有明顯的地域差異，使用本地區(qū)血清型菌株制備自家滅活疫苗，是預防本病的有效途徑[2，4]。本研究結果表明，以氫氧化鋁為佐劑的滅活疫苗具有較高的安全性，且經皮下注射后能被機體很好地吸收。本研究制備的滅活疫苗具有良好的免疫效果，免疫42 d后，93.3%以上免疫牛的抗體效價達到1∶32以上；免疫180 d后，80.0%以上免疫牛的抗體水平仍保持在1∶32以上。以90億的致病菌攻毒，免疫牛全部存活，而且無不良反應，表明該疫苗的免疫保護性良好。