王司原，崔可欣，楊小淦，梁興偉

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院亞熱帶生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實驗室，廣西 南寧 530004）

脂肪沉積對畜牧生產(chǎn)的影響十分明顯，皮下脂肪沉積與瘦肉率直接相關(guān)[1]，同時，脂肪沉積對畜禽的繁殖性能也有影響[2]。家畜脂肪沉積過度可引起飼料轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟(jì)效益降低，并造成環(huán)境污染。然而，當(dāng)今脂肪沉積調(diào)節(jié)途徑及機(jī)制并未被全面闡述，仍然是困擾畜牧生產(chǎn)的主要問題。因此，尋求有效的脂肪沉積調(diào)節(jié)途徑有望提高畜禽生產(chǎn)性能，迎合消費(fèi)者需求。

影響脂肪沉積的因素是多方面的，如營養(yǎng)因素、遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境等。日糧的能量水平、飼料配方、飼料添加劑的合理使用及限飼手段可以調(diào)節(jié)脂肪沉積。此外，家畜機(jī)體過氧化物酶體增殖物激活受體、脂肪酸結(jié)合蛋白基因、解耦聯(lián)蛋白、脂蛋白脂酶基因及激素敏感脂酶基因的表達(dá)也會影響脂肪沉積[3]。同時，飼養(yǎng)環(huán)境管控也是影響脂肪沉積的因素之一，溫度、濕度及光照條件等對家畜的脂肪沉積會產(chǎn)生影響[4]。歸根結(jié)底，家畜脂肪沉積源于脂肪代謝、脂肪分解的平衡，脂肪能量代謝活性降低會導(dǎo)致脂質(zhì)過度積累，造成脂肪沉積。不法分子為追求利益，使用瘦肉精干預(yù)脂肪代謝，從而提高瘦肉產(chǎn)量，對消費(fèi)者的生命安全造成威脅。因此，尋找安全便捷的脂肪沉積調(diào)節(jié)途徑尤為重要。

羅漢果是廣西地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物，食藥功能兼?zhèn)?，是我國的?yōu)質(zhì)中藥材，也是當(dāng)今市場上頗受歡迎的綠色食品添加劑。羅漢果甜苷是其主要活性成分，甜度高、熱量低，生理功能豐富多樣，包括但不限于降血壓、降血糖、消炎抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、有益于生殖等[5-8]。越來越多的報道顯示，羅漢果甜苷具有調(diào)節(jié)脂肪沉積的潛力[9-10]，然而其實現(xiàn)作用的途徑及機(jī)制并未被充分報道。

本試驗旨在對羅漢果甜苷調(diào)節(jié)脂肪沉積的作用途徑進(jìn)行初步探索，利用模型動物構(gòu)建脂肪沉積模型，探究羅漢果甜苷發(fā)揮作用的可能途徑，為羅漢果甜苷在改善肉質(zhì)品質(zhì)中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理方法

選取24只4周齡、雄性健康、體重為15±0.5 g的C57BL/6小鼠作為實驗動物。按飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，在光照周期為12 h、室內(nèi)溫度為22±2℃、濕度為50%～60%的IVC環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，自由采食和飲水，進(jìn)行為期1周的環(huán)境適應(yīng)。于小鼠5周齡時開始試驗，每天上午9∶00對各組小鼠進(jìn)行給藥處理，對照組和高脂飲食組每天灌胃等劑量的(5μL/g)蒸餾水，羅漢果甜苷處理組每天灌胃600 mg/kg的羅漢果甜苷，所選濃度由預(yù)試驗得出。試驗期間每周記錄采食量并稱取體重，調(diào)整給藥量，連續(xù)處理17周。

1.2 主要試劑

維持鼠糧及高脂日糧均購自Research Diets公司；羅漢果甜苷提取物購自桂林萊茵生物科技股份有限公司（產(chǎn)品型號：羅漢果甜苷V 50%-MOV04，生產(chǎn)批號：MOV04-18022504）；蘇木精伊紅染液購自北京索萊寶公司。

1.3 小鼠身體組成分析

將活體小鼠置于小動物身體成分分析儀中進(jìn)行無創(chuàng)活體檢測。檢測前使用菜籽油進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，校準(zhǔn)結(jié)束后對每只小鼠稱重。稱重后將小鼠放入機(jī)器配套的測定管，在不傷害小鼠的前提下固定，使得小鼠無法輕易活動。輸入小鼠體重數(shù)據(jù)后，將測定管放入機(jī)器開始測量，獲得脂肪含量數(shù)據(jù)、瘦肉率后將小鼠放回原飼養(yǎng)籠。

1.4 脂肪樣本收集及形態(tài)觀察

試驗結(jié)束后，對小鼠進(jìn)行二氧化碳麻醉，收集小鼠的血液、皮下脂肪組織并置于準(zhǔn)備好的10%福爾馬林固定液中，剩下的樣本放在-196℃的液氮中，凍存于-80℃冰箱中備用。蘇木精伊紅 （hematoxylin and eosin,H&E）染色按照標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。

1.5 皮下脂肪轉(zhuǎn)錄組分析

測序文庫由北京百邁客公司制備，原始下機(jī)數(shù)據(jù)借助廣西大學(xué)多功能并行運(yùn)算平臺完成分析。首先，原始數(shù)據(jù)經(jīng)去接頭、去冗余等質(zhì)控步驟，保留堿基質(zhì)量 Q＞30的純凈序列（clean reads），采用 STAR 軟件對比到小鼠參考基因組 （GRC_m39,Mus musculus），平均對比率達(dá)到95%以上。之后利用Feature_counts軟件進(jìn)行reads計數(shù)，得到的表達(dá)量信息采用DESeq2軟件進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。提取P＜0.01的基因進(jìn)行GO及KEGG富集。

1.6 血清LC-MS/MS檢測

取冷凍的血清樣本100μL，并添加3倍體積的甲醇，充分振蕩均勻后進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)移上清液并用氮?dú)獯蹈桑砑?0μL甲醇復(fù)溶，離心后取上清液上機(jī)檢測。利用 HPLC-MS系統(tǒng) （Thermo Fisher Scientific,USA），采用非靶向代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析。色譜柱采用Accucore C18柱 （2.6μm,50 mm×2.1 mm,Thermo Fisher Scientific,USA）。流動相由含有0.025%甲酸的水和甲醇組成，流速為50μL/min。水/甲醇的梯度程序如下：0 min，60%B；2min，60%B；9 min，100%B；17 min，100%B；18 min，60%B。 流動相流程完畢進(jìn)行洗滌和重新平衡，總運(yùn)行時長為25 min。質(zhì)譜模式下的進(jìn)樣量為2μL，分別在正離子和負(fù)離子模式下掃描。電離參數(shù)如下：噴霧電壓為4.2 kV；鞘層氣體（氮?dú)猓?5個任意單位（arb）；輔助氣體和掃氣（氮?dú)猓? arb；毛細(xì)管電壓為37 V；毛細(xì)管溫度為275℃；管鏡為80 V。掃描范圍設(shè)置為50～1 200 m/z。下機(jī)數(shù)據(jù)在Compound discoverer 3.1軟件分析（Thermo Fisher Scientific），使用 mzCloud（ddMS2）和ChemSpider進(jìn)行物質(zhì)識別定性處理。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行分析。兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異采用t檢驗，超過兩組的統(tǒng)計學(xué)差異采用方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠身體成分的影響

如圖1A所示，與對照組相比，高脂飲食造成小鼠卡路里攝入量增加，而羅漢果甜苷處理組與高脂飲食組的卡路里攝入量無顯著差異。各組小鼠初始體重?zé)o顯著差異，試驗處理結(jié)束后，與對照組相比，高脂飲食顯著增加了小鼠體重（圖1B）、體脂率（圖1C），顯著降低了肌肉率（圖1D）。然而補(bǔ)充羅漢果甜苷均能顯著緩解上述指標(biāo)變化。

圖1 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠身體成分的影響

2.2 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響

為探究羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響，我們首先對各組小鼠皮下脂肪重量進(jìn)行稱重（如圖2A所示）。與對照組相比，高脂飲食導(dǎo)致小鼠皮下脂肪重量顯著升高，而經(jīng)羅漢果甜苷處理，小鼠皮下脂肪重量得到顯著恢復(fù)。隨后我們對各組小鼠皮下脂肪組織形態(tài)進(jìn)行H&E染色觀察（如圖2B顯示）。同比對照組，高脂飲食造成小鼠皮下脂肪細(xì)胞膨大，同時，脂肪細(xì)胞直徑增加（圖2C-D）。以上現(xiàn)象經(jīng)羅漢果甜苷處理得到顯著改善。

圖2 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪沉積的影響

2.3 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪基因表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果展示各組小鼠皮下脂肪基因表達(dá)的情況（如圖3A所示）。主成分分析顯示，各組小鼠皮下脂肪基因表達(dá)的聚類模式不盡相同 （圖3B），通過對差異表達(dá)基因（DEG）的篩選，同對照組相比，高脂飲食引起1 560個基因表達(dá)情況發(fā)生顯著改變，經(jīng)羅漢果甜苷處理，681個基因的表達(dá)顯著恢復(fù)。對恢復(fù)表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集到脂肪酸代謝通路，包括脂肪酸的β氧化、脂肪酸的生物合成及脂質(zhì)代謝等通路。KEGG分析結(jié)果顯示，恢復(fù)的基因主要富集到ppar信號通路及代謝通路等。提示經(jīng)羅漢果甜苷處理可能對脂肪酸代謝通路起調(diào)控作用。

圖3 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠皮下脂肪基因表達(dá)的影響

2.4 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠血清代謝的影響

為進(jìn)一步驗證羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠脂肪沉積的影響，本試驗采用LC-MS/MS對各組小鼠血清代謝產(chǎn)物進(jìn)行了非靶向代謝分析。經(jīng)定性，筆者發(fā)現(xiàn)羅漢果甜苷處理能夠恢復(fù)三羧酸循環(huán)相關(guān)分子及脂肪酸類分子的改變，脂肪酸類代謝分子占據(jù)較大比重。同時還發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷處理能夠顯著減輕高脂飲食引起的血清尿酸、花生四烯酸含量的增加，證明羅漢果甜苷具有調(diào)節(jié)血清代謝的作用。

3 討論

脂肪沉積對畜牧生產(chǎn)的影響顯著，皮下脂肪沉積是影響瘦肉率最主要的因素。采取安全有效的脂肪沉積調(diào)節(jié)途徑能夠有效提高肉品質(zhì)，提高畜牧生產(chǎn)效益。事實表明，羅漢果甜苷具有調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪沉積的作用[11]，然而其實現(xiàn)途徑及機(jī)制并未被完全報道。有研究指出，羅漢果甜苷可以激活肝臟AMPK通路，促進(jìn)肝臟能量代謝以減輕肝臟脂肪沉積[7,12-13]。此外，羅漢果甜苷處理能夠改善小鼠胰島素敏感性及糖耐量受損，從而減輕高脂飲食造成的小鼠體重增加[14-15]。然而，關(guān)于羅漢果甜苷對脂肪沉積的影響途徑尚未見報道。

本試驗結(jié)果顯示，高脂飲食造成小鼠體重、體脂的顯著提升，瘦肉率顯著下降，同時高脂飲食造成小鼠皮下脂肪含量顯著增加，脂肪形態(tài)改變。但是經(jīng)羅漢果甜苷處理，上述情況均得到顯著改善。另一方面，高脂飲食造成小鼠皮下脂肪組織基因表達(dá)情況改變，部分與脂代謝、脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá)改變可經(jīng)羅漢果甜苷處理恢復(fù)正常。此外，羅漢果甜苷可以調(diào)節(jié)血清代謝，恢復(fù)包括尿酸、花生四烯酸等代謝產(chǎn)物的變化。上述結(jié)果顯示，羅漢果甜苷對小鼠脂肪沉積具有明顯的調(diào)節(jié)作用，然而對其深入的作用機(jī)制需要驗證。

圖4 羅漢果甜苷對高脂飲食小鼠血清代謝的影響

4 結(jié)論

羅漢果甜苷可以減輕高脂飲食造成的小鼠皮下脂肪沉積，其實現(xiàn)途徑可能與調(diào)節(jié)皮下脂肪轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、調(diào)節(jié)血清代謝有關(guān)。