樊宗芳, 陳亞平, 樊 銳, 和淑琪, 桂富榮

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 云南省生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201)

全球氣候變化是當(dāng)今人類(lèi)所面臨最迫切的環(huán)境問(wèn)題之一，而大氣中二氧化碳(CO2)濃度的不斷升高是引起全球氣候變化的一個(gè)主要原因(陳瑜和馬春森, 2010)。當(dāng)前大氣CO2濃度已從工業(yè)革命前的280 μL/L上升至415 μL/L(https:∥www.esrl.noaa.gov/gmd/ccgg/trends/global.html)，預(yù)計(jì)到21世紀(jì)末大氣中CO2濃度將達(dá)到800 μL/L(IPCC, 2014)。西花薊馬Frankliniellaoccidentalis是入侵我國(guó)并造成嚴(yán)重危害的害蟲(chóng)(Reitzetal., 2020)，在多個(gè)國(guó)家的許多作物上造成危害(Reitzetal., 2011)?；ㄋE馬Frankliniellaintona為西花薊馬的本地近緣種，同為雜食性昆蟲(chóng)，主要危害棉花、水稻和蔬菜等，在田間常與西花薊馬混合發(fā)生，是云南省的主要薊馬種類(lèi)(蔣興川等, 2013; Limetal., 2013)。至今大多數(shù)國(guó)家對(duì)薊馬的防治仍然以化學(xué)防治為主，但是大量不合理地使用殺蟲(chóng)劑加速了其抗藥性發(fā)展，目前已對(duì)大部分殺蟲(chóng)劑(有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑和多殺菌素等)產(chǎn)生了不同程度的抗性(Moudenetal., 2017)。據(jù)報(bào)道，新型取代芳基吡咯類(lèi)殺蟲(chóng)劑蟲(chóng)螨腈和新型吡唑雜環(huán)類(lèi)殺蟲(chóng)劑唑蟲(chóng)酰胺對(duì)薊馬有較好的防治效果(Misra and Sahu, 2018; Gaoetal., 2020)。研究高CO2濃度下殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬保護(hù)酶[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)]、解毒酶[羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase, GST)和細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450 enzyme system, CYP450)]和乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase, AChE)活性的影響，從生化水平闡明將來(lái)大氣CO2濃度不斷升高的環(huán)境條件下，蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)兩種薊馬的毒理作用，可為生產(chǎn)上合理使用殺蟲(chóng)劑提供理論依據(jù)，并對(duì)進(jìn)一步研究薊馬對(duì)蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺的抗性管理具有一定的指導(dǎo)意義，以便及時(shí)做出害蟲(chóng)管理策略的調(diào)整，對(duì)維護(hù)西南生態(tài)安全提供保障。

昆蟲(chóng)對(duì)周?chē)h(huán)境的變化極其敏感，外界環(huán)境變化時(shí)，昆蟲(chóng)體內(nèi)酶系會(huì)被各種外源或內(nèi)源化合物誘導(dǎo)，使昆蟲(chóng)迅速找到最適的生存對(duì)策(劉建業(yè)等, 2017)。SOD, POD和CAT是昆蟲(chóng)體內(nèi)主要的保護(hù)酶，主要參與廣泛的應(yīng)激反應(yīng)(Felton and Summers, 1995; Yang and Lee, 2015)。CarE, GST和AChE是昆蟲(chóng)體內(nèi)的主要解毒代謝酶，大量文獻(xiàn)表明，昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶解毒能力增強(qiáng)是其對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生代謝抗性的主要原因之一(陳澄宇等, 2016)。研究發(fā)現(xiàn)高CO2濃度顯著升高了西花薊馬和黃胸薊馬Thripshawaiiensis成蟲(chóng)體內(nèi)的CarE, AChE和GST活性，同時(shí)，高CO2有利于西花薊馬種群發(fā)展，而不利于黃胸薊馬種群發(fā)展(Caoetal., 2021)。據(jù)Bezemer等(1998)和Osbrink等(1987)報(bào)道，高CO2濃度分別增加了桃蚜Myzuspersicae的種群數(shù)量以及粉紋夜蛾Trichoplusiani對(duì)植物的消耗量。此外，高CO2濃度增強(qiáng)了煙粉虱Bemisiatabaci體內(nèi)POD和GST活性，但降低了SOD和CAT活性(李寧等, 2016)。二斑葉螨Tetranychusurticae蟲(chóng)螨腈抗性品種(抗性倍數(shù)為154倍)體內(nèi)單加氧酶(monooxygenase, MO)和酯酶(esterase, EST)活性增強(qiáng)(Leeuwenetal., 2005)。家蠅Muscadomestica經(jīng)蟲(chóng)螨腈汏選10代后，其體內(nèi)MO活性增強(qiáng)(Silivanovaetal., 2020)。張文成等(2009)報(bào)道蟲(chóng)螨腈亞致死劑量處理甜菜夜蛾Spodopteraexigua4齡幼蟲(chóng)48 h后，其體內(nèi)僅CYP450活性顯著升高，其他酶(SOD, POD, CAT, CarE和GST)活性均沒(méi)有顯著變化。唑蟲(chóng)酰胺亞致死濃度對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella體內(nèi)的EST, GST和MFO均有明顯的抑制作用(陳潔瓊等, 2014)。據(jù)Wimer(2013)報(bào)道，經(jīng)唑蟲(chóng)酰胺處理后的馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata體內(nèi)GST活性顯著增強(qiáng)。

目前關(guān)于蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)昆蟲(chóng)的亞致死效應(yīng)研究主要集中在正常大氣CO2濃度下鱗翅目昆蟲(chóng)上，很少涉及高CO2濃度下對(duì)纓翅目昆蟲(chóng)的研究，尤其是對(duì)入侵物種和本地物種的亞致死效應(yīng)的差異比較。本研究通過(guò)比較高CO2條件下用LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理入侵種西花薊馬和本地近緣種花薊馬成蟲(chóng)后，其體內(nèi)保護(hù)酶、解毒酶以及乙酰膽堿酯酶活性的變化差異，以期預(yù)測(cè)未來(lái)大氣CO2濃度不斷升高的環(huán)境下，西花薊馬和花薊馬對(duì)蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺的代謝抗性發(fā)展，并為進(jìn)一步研究?jī)蓚€(gè)物種的抗藥性管理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人工氣候箱設(shè)置

人工氣候箱(上海三騰儀器 LTC-1000)溫度為25℃±1℃，相對(duì)濕度為 65%±5%，光周期為 16L∶8D。實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)CO2濃度：400 μL/L(正常CO2濃度，接近于當(dāng)前大氣CO2濃度)和800 μL/L(高CO2濃度，預(yù)計(jì)21世紀(jì)末大氣中CO2濃度)。人工氣候箱24 h通氣，每30 min自動(dòng)記錄并調(diào)整CO2濃度值。

1.2 供試植株及蟲(chóng)源

供試四季豆Phaseolusvulgaris品種為綠洲，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行種植(25°80′N(xiāo), 102°45′E)，期間每2天澆一次水，采摘成熟的四季豆莢，清洗后用于薊馬種群的飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間不施用任何化肥及農(nóng)藥。

西花薊馬和花薊馬種群均采自云南省昆明市呈貢區(qū)斗南花卉苗圃培育基地(24°54′N(xiāo), 102°46′E)，在室內(nèi)進(jìn)行種類(lèi)鑒定后，分別用四季豆莢飼養(yǎng)于上述不同CO2濃度的人工氣候箱內(nèi)，試驗(yàn)用蟲(chóng)在室內(nèi)繼代飼養(yǎng)30代以上，期間未接觸任何殺蟲(chóng)劑。

1.3 供試試劑

蟲(chóng)螨腈(98%)和唑蟲(chóng)酰胺(96%)分別購(gòu)于山東濰坊雙星農(nóng)藥有限公司和青島海利爾藥業(yè)有限公司。保護(hù)酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司，CYP450 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海優(yōu)選生物科技有限公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 殺蟲(chóng)劑母液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 mg蟲(chóng)螨腈和3.3333 g唑蟲(chóng)酰胺原藥，分別加入1 mL的丙酮和15 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，作為母液備用。

1.5 殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬的生物活性測(cè)定

用0.1% 吐溫-80將母液稀釋成5個(gè)濃度梯度。蟲(chóng)螨腈: 0.175, 0.35, 0.7, 0.14和2.8 mg/L(西花薊馬, 400和 800 μL/L)；0.2, 0.4, 0.6, 0.8和1.0 mg/L(花薊馬, 400 和800 μL/L)；唑蟲(chóng)酰胺：100, 200, 400, 800和1 600 mg/L(西花薊馬, 400 μL/L)；200, 400, 800, 1600和3 200 mg/L(西花薊馬, 800 μL/L)；200, 400, 600, 800和1 000 mg/L(花薊馬, 400 μL/L)；100, 200, 300, 400和500 mg/L(花薊馬, 800 μL/L)。采用浸漬法對(duì)西花薊馬和花薊馬種群進(jìn)行毒力測(cè)定，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以0.1%吐溫-80為對(duì)照。將培養(yǎng)皿(d=60 mm)和豆莢(長(zhǎng)約50 mm)分別在藥液中浸泡2 h和15 s，取出后自然晾干；每個(gè)皿中放入一根豆莢(皿和豆莢濃度對(duì)應(yīng))，并接入50頭羽化后2 d的薊馬成蟲(chóng)，用帶孔保鮮膜封口后放入上述條件的人工培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，48 h后觀察并記錄薊馬存活情況(用毛筆輕觸蟲(chóng)體無(wú)反應(yīng)則視為死亡)，計(jì)算西花薊馬和花薊馬的LC25和LC50值。以上處理均在兩個(gè)CO2濃度(400和800 μL/L)下進(jìn)行。

1.6 薊馬成蟲(chóng)酶液的提取

為了統(tǒng)一處理薊馬的殺蟲(chóng)劑濃度，選取兩個(gè)CO2濃度下殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬的亞致死濃度(LC25)中間值。用LC25濃度的殺蟲(chóng)劑處理兩個(gè)CO2濃度下羽化2 d的薊馬成蟲(chóng)48 h后，挑取存活的薊馬，每20頭裝入一個(gè)2 mL離心管中(Biosharp, Beijing Labgic Technology Co., Ltd.)，以0.1% 吐溫-80為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，液氮處理后于-80℃保存待用。

酶液制備參照劉建業(yè)等(2014)和Cao等(2021)的方法。取20頭待測(cè)薊馬，加入1 800 μL生理鹽水(0.4%)，將其在冰浴中勻漿(Tissuelyser-48, 上海凈信科技)， 4℃ 2 500 r/min 離心10 min后取上清作為保護(hù)酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)]待測(cè)酶液。取20頭待測(cè)薊馬，加入1 200 μL磷酸緩沖液(PBS, 0.1 mol/L, pH 7.6)，將其在冰浴上勻漿， 4℃ 10 000 r/min離心15 min后取上清作為羧酸酯酶(CarE)、谷光甘肽S-轉(zhuǎn)移酸(GST)和乙酰膽堿酯酶(AChE)待測(cè)酶液。取20頭待測(cè)薊馬，加入1 200 μL 0.86%生理鹽水，將其在冰浴上勻漿，3 000 r/min 離心10 min后取上清作為細(xì)胞色素P450(CYP450)待測(cè)酶液。

1.7 薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)酶活性的測(cè)定

參考Bradford(1976)方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，先用牛血清白蛋白作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。將200 μL待測(cè)酶溶液與2.0 mL 0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染色液(Solarbio, 北京)震蕩混勻，靜置10 min后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1 800, MAPADA, 上海)在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)其OD值。

保護(hù)酶和CYP450活性分別嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)以及ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算。CarE活性測(cè)定參照張凱倫等(2020)方法，并做適當(dāng)改良。在10 mL PBS(0.2 mol/L, pH 6.0)中加入20 mg固藍(lán)RR鹽和0.2 mL α-乙酸萘酯(100 mmol/L)，震蕩混勻，過(guò)濾得到底物和顯色劑混合液。在酶標(biāo)板中加入20 μL酶溶液和200 μL底物和顯色劑混合液，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm下記錄吸光度值，每30 s記錄一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)5 min。GST活性測(cè)定參照Cao等(2021)方法，在酶標(biāo)板中加入20 μL酶液，100 μL 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB, 2 mmol/L)和100 μL還原型谷胱甘肽(GSH, 12.5 mmol/L)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)340 nm下記錄吸光度值，每30 s記錄一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)5 min。AChE活性測(cè)定參照高希武(1987)方法，將100 μL碘化乙酰硫代膽堿(5×10-4mol/L), 0.9 mL PBS(0.1 mol/L, pH 7.5)和10 μL酶液加入離心管中搖勻，37℃水浴20 min后，加入1 mL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)-磷酸乙醇顯色劑[2.4 mg DTNB中加入120 mL乙醇(96%)和80 mL蒸餾水，用0.1 mol pH 7.6 的PBS定容至250 mL]，靜置10 min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度值。CarE, GST以及AChE活性均按產(chǎn)物生成量計(jì)算。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件計(jì)算殺蟲(chóng)劑對(duì)薊馬的亞致死濃度(LC25)和致死中濃度(LC50)以及毒力回歸方程；使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)(independent-samplesT-test)比較兩個(gè)物種之間和兩個(gè)CO2濃度之間的差異顯著性(P<0.05)；單因素方差分析(one-way ANOVA, LSD)比較3個(gè)不同處理之間的差異顯著性(P<0.05)；采用三因素方差分析(three-way ANOVA)對(duì)CO2濃度、薊馬種類(lèi)以及殺蟲(chóng)劑處理3個(gè)主效因子及其交互作用對(duì)保護(hù)酶、解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同CO2濃度下蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)的毒力

800 μL/L CO2下蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)的毒力較400 μL/L CO2下增強(qiáng)(表1)。800 μL/L CO2下，蟲(chóng)螨腈對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)的致死中濃度(LC50)分別為1.33和0.37 mg/L，分別是400 μL/L CO2下的0.68和0.66倍；亞致死濃度(LC25)分別為0.60和0.24 mg/L，分別是400 μL/L CO2下的 0.61和0.83倍。唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)的LC50值分別為1 002.64和247.66 mg/L，分別是400 μL/L CO2下的0.98和0.78倍；LC25值分別為368.77和146.10 mg/L，分別是400 μL/L CO2下的2.44和1.21倍。

表1 不同CO2濃度下蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)的毒力Table 1 Toxicities of chlorfenapyr and tolfenpyrad to Frankliniella occidentalis and F. intonsa adultsunder different CO2 concentrations at 48 h after treatment

2.2 高CO2濃度下蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

800 μL/L CO2下，蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺均增強(qiáng)了兩種薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的保護(hù)酶活性(表2)。CO2濃度、薊馬種類(lèi)以及殺蟲(chóng)劑處理3個(gè)主效因子對(duì)保護(hù)酶活性均有極顯著影響(SOD:FCO2濃度=35.036,F薊馬種類(lèi)=336.910,F殺蟲(chóng)劑處理=315.808,P<0.001; POD:FCO2濃度=109.780,F薊馬種類(lèi)=138.828,F殺蟲(chóng)劑處理=64.374,P<0.001; CAT:FCO2濃度=50.238,F薊馬種類(lèi)=4 356.153,F殺蟲(chóng)劑處理=289.781,P<0.001)；3個(gè)主效因子之間兩兩交互作用對(duì)SOD和POD活性有顯著影響(P<0.05)(表2)。

表2 不同濃度CO2下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)保護(hù)酶活性影響的三因素方差分析Table 2 Three-way analyses of variance for the effects of LC25 of chlorfenapyr and tolfenpyrad on protectiveenzyme activities in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa under different CO2 concentrations

800 μL/L CO2下，經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性較對(duì)照均升高(表3)，且西花薊馬SOD活性顯著高于花薊馬SOD活性(蟲(chóng)螨腈:t=-11.161,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=-13.257,P<0.05)，與400 μL/L CO2下經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理后的西花薊馬和花薊馬體內(nèi)SOD活性變化一致。其中，800 μL/L CO2下，經(jīng)LC25濃度唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)SOD活性均達(dá)最高，分別為39.74±1.59和14.19±1.09 U/mg pro，顯著高于蟲(chóng)螨腈處理組和對(duì)照(P<0.05)。800 μL/L CO2下西花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后，其體內(nèi)SOD活性均顯著高于400 μL/L CO2下LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后其體內(nèi)的SOD活性(唑蟲(chóng)酰胺:t=-5.260,P<0.05; 蟲(chóng)螨腈:t=-4.353,P<0.05)，而花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈處理48 h后，其體內(nèi)SOD活性略低于400 μL/L CO2下LC25濃度蟲(chóng)螨腈處理48 h后的SOD活性(t=1.550,P>0.05)。

表3 不同 CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的SOD活性(U/mg pro)Table 3 SOD activities (U/mg pro) in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25of chlorfenapyr and tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrations

800 μL/L CO2下，經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)POD活性均顯著升高(P<0.05, 表4)，且西花薊馬POD活性均顯著高于花薊馬POD活性(蟲(chóng)螨腈:t=-3.503,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=-3.650,P<0.05)。其中，800 μL/L CO2下，花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后，其體內(nèi)POD活性均顯著高于400 μL/L CO2下LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后的POD活性(唑蟲(chóng)酰胺:t=-3.258,P<0.05; 蟲(chóng)螨腈:t=-14.276,P<0.05)；而西花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，其體內(nèi)POD活性與400 μL/L CO2下LC25濃度唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后的POD活性之間未出現(xiàn)著差異(t=-1.385,P>0.05)。

表4 不同CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的POD活性(U/mg pro)Table 4 POD activities (U/mg pro) in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25of chlorfenapyr and tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrations

800 μL/L CO2下，經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后的西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性均顯著升高(P<0.05)(表5)，且西花薊馬CAT活性始終顯著高于花薊馬CAT活性(蟲(chóng)螨腈:t=-31.737,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=-24.620,P<0.05)，其中，西花薊馬經(jīng)唑蟲(chóng)酰胺處理后其體內(nèi)CAT活性達(dá)最高(37.93±1.31 U/mg pro)，且顯著高于蟲(chóng)螨腈處理組(P<0.05)，是蟲(chóng)螨腈處理組的1.59倍，而花薊馬體內(nèi)CAT活性在兩種殺蟲(chóng)劑處理之間未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，與400 μL/L CO2下經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CAT活性變化一致。800 μL/L CO2下，西花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后，其體內(nèi)CAT活性顯著高于400 μL/L CO2下LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理后的CAT活性(蟲(chóng)螨腈:t=-4.494,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=-2.993,P<0.05)，而花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈處理后，其體內(nèi)CAT活性與400 μL/L CO2下LC25濃度蟲(chóng)螨腈處理后的CAT活性之間未出現(xiàn)顯著差異(t=-2.495,P>0.05)。

表5 不同 CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的CAT活性(U/mg pro)Table 5 CAT activities (U/mg pro) in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25 of chlorfenapyrand tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrations

2.3 CO2濃度下蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響

800 μL/L CO2下，LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)兩種薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響存在一定差異。CO2濃度、薊馬種類(lèi)以及殺蟲(chóng)劑處理3個(gè)主效因子對(duì)CarE, GST以及AChE活性均有顯著影響(CarE:FCO2濃度=36.037,F薊馬種類(lèi)=21.758,F殺蟲(chóng)劑處理=5.855,P<0.01; GST:FCO2濃度=30.433,F薊馬種類(lèi)=20.573,F殺蟲(chóng)劑處理=25.270,P<0.001; AChE:FCO2濃度=92.906,F薊馬種類(lèi)=380.417,F殺蟲(chóng)劑處理=103.553,P<0.001)，而對(duì)于CYP450而言，僅殺蟲(chóng)劑處理對(duì)其活性有顯著影響(F殺蟲(chóng)劑處理=5.483,P<0.05)；3個(gè)主效因子之間的交互作用(兩兩相交和三因素相交)對(duì)AChE活性有顯著影響(P<0.05)(表6)。

表6 不同 CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性影響的三因素方差分析Table 6 Three-way analyses of variance for the effects of LC25 of chlorfenapyr and tolfenpyradon the activities of detoxifying enzymes and AChE in adults of Frankliniella occidentalisand F. intonsa under different CO2 concentrations

800 μL/L CO2下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CarE活性影響存在一定差異(圖1)。其中，經(jīng)蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理后，西花薊馬體內(nèi)CarE活性均顯著降低(P<0.05)，而花薊馬體內(nèi)CarE活性升高，與400 μL/L CO2下經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CarE活性變化趨勢(shì)一致。800 μL/L CO2下，花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，其體內(nèi)CarE活性達(dá)最高(35.36±0.55 μmol/min·mg pro)，顯著高于蟲(chóng)螨腈處理組和對(duì)照(P<0.05)，分別是其的1.25和1.29倍，而蟲(chóng)螨腈處理組和對(duì)照之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 不同CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的CarE活性Fig. 1 CarE activities in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25 of chlorfenapyrand tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrationsA: 800 μL/L CO2; B: 400 μL/L CO2. 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上不同小寫(xiě)字母表示同一CO2濃度同一物種不同處理之間差異顯著(P<0.05, LSD)；不同大寫(xiě)字母表示同一物種同一處理不同CO2濃度之間差異顯著(P<0.05, 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))；星號(hào)表示同一CO2濃度同一處理兩物種之間差異顯著(P<0.05, 獨(dú)立樣本T檢驗(yàn))。Data in the table are means±SE. Different lowercase letters above bars represent significant difference among treatments of the same species under the same CO2 concentration (P<0.05, LSD). Different uppercase letters represent significant differences between different CO2 concentrations within the same treatment of the same species (P<0.05, independent samples T-test). Asterisks represent significant differences between the two species in the same treatment under the same CO2 concentration (P<0.05, independent samples T-test). 下圖同。The same for the following figures.

400和800 μL/L CO2下，經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)GST活性較對(duì)照均升高(圖2: A, B)。其中，800 μL/L CO2下蟲(chóng)螨腈處理48 h后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的GST活性均達(dá)最高，分別為3.36±0.12和2.57±0.08 μmol/min·mg pro，顯著高于對(duì)照和唑蟲(chóng)酰胺處理組(P<0.05)(圖2: A)。800 μL/L CO2下經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)GST活性顯著高于花薊馬GST活性 (蟲(chóng)螨腈:t=5.368,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=7.723,P<0.05)和400 μL/L CO2下LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理48 h后西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)GST活性(蟲(chóng)螨腈:t=6.306,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=4.092,P<0.05)；而400 μL/L CO2下，經(jīng)LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的GST活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的GST活性Fig. 2 GST activities in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25 of chlorfenapyrand tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrationsA: 800 μL/L CO2; B: 400 μL/L CO2.

800 μL/L CO2下，LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h對(duì)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP450活性沒(méi)有顯著影響(P>0.05)(圖3: A)；400 μL/L CO2下，LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h對(duì)西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP450活性也沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，但LC25濃度蟲(chóng)螨腈處理48 h后，花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP450活性較對(duì)照顯著升高(P<0.05)(圖3: B)。同時(shí)，800 μL/L CO2下，LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后這兩種薊馬CYP450活性之間也無(wú)顯著差異(P>0.05)，這與400 μL/L CO2下兩種薊馬之間CYP450活性差異一致。

800 μL/L CO2下，LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)AChE活性均顯著升高(P<0.05)(圖4)，且西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的AChE活性顯著高于花薊馬成蟲(chóng)的(蟲(chóng)螨腈:t=2.922,P<0.05; 唑蟲(chóng)酰胺:t=2.835,P<0.05)，與400 μL/L CO2下經(jīng)LC25濃度的這兩種殺蟲(chóng)劑處理后西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)AChE活性變化一致。其中，800 μL/L CO2下，西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)經(jīng)LC25濃度唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后，其體內(nèi)AChE活性最高，分別為45.19±0.53和41.16±1.32 μmol/min·mg pro，顯著高于蟲(chóng)螨腈處理組和400 μL/L CO2下LC25濃度唑蟲(chóng)酰胺處理48 h后兩種薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的AChE活性(P<0.05)。

圖3 不同CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP450活性Fig. 3 CYP450 activities in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25 of chlorfenapyrand tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrationsA: 800 μL/L CO2; B: 400 μL/L CO2.

圖4 不同CO2濃度下LC25濃度蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺處理48 h時(shí)西花薊馬和花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)的AChE活性Fig. 4 AChE activities in adults of Frankliniella occidentalis and F. intonsa exposed to LC25 of chlorfenapyrand tolfenpyrad for 48 h under different CO2 concentrationsA: 800 μL/L CO2; B: 400 μL/L CO2.

3 討論

目前全球氣候變化已成為國(guó)內(nèi)外最受關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題之一。以大氣CO2濃度升高為特征的氣候變化可對(duì)植食性昆蟲(chóng)產(chǎn)生直接或間接影響(Heetal., 2017; Qianetal., 2018, 2021; Caoetal., 2021)。本試驗(yàn)主要研究了大氣CO2濃度升高對(duì)西花薊馬和花薊馬的直接影響，結(jié)果表明高CO2濃度可增強(qiáng)殺蟲(chóng)劑的殺蟲(chóng)活性。先前研究表明在CO2氣調(diào)中加入適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥劑可以加速蟲(chóng)體的死亡(吳仕源等, 1997)，與本研究結(jié)果相似。原因可能是高CO2濃度通過(guò)呼吸作用直接影響昆蟲(chóng)的生理生化代謝過(guò)程(Colinet and Renault, 2012)。蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺對(duì)本地種花薊馬的毒力大于對(duì)入侵種西花薊馬的毒力。張曉明等(2018)研究表明，6種常用殺蟲(chóng)劑對(duì)花薊馬2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)(雌、雄)的毒力均大于對(duì)西花薊馬各蟲(chóng)態(tài)的毒力，與本研究結(jié)果相似。該結(jié)果符合入侵物種與本地物種相互競(jìng)爭(zhēng)時(shí)的內(nèi)在優(yōu)勢(shì)假說(shuō)(萬(wàn)方浩, 2011)。

昆蟲(chóng)在逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧增加，對(duì)許多生物功能分子有破壞作用，因此昆蟲(chóng)體內(nèi)普遍存在著一個(gè)清除自由基的保護(hù)體系，如SOD, POD和CAT等保護(hù)酶系統(tǒng)；已有研究表明昆蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶活性水平與抗藥性有一定相關(guān)性(李周直等, 1994)。本研究中僅800 μL/L CO2處理西花薊馬和花薊馬時(shí)，兩種薊馬體內(nèi)SOD活性略降低, POD和CAT活性均升高(表3-5)，與劉建業(yè)等(2014)研究結(jié)果類(lèi)似。其中西花薊馬體內(nèi)CAT活性顯著增強(qiáng)，而花薊馬體內(nèi)則是POD活性顯著升高，說(shuō)明西花薊馬主要通過(guò)升高體內(nèi)CAT活性來(lái)清除體內(nèi)H2O2，以應(yīng)對(duì)高CO2濃度脅迫，而花薊馬主要通過(guò)升高體內(nèi)POD活性來(lái)清除體內(nèi)H2O2，表明不同物種在響應(yīng)高CO2濃度脅迫時(shí)其生理響應(yīng)機(jī)理不同。僅殺蟲(chóng)劑處理兩種薊馬時(shí)，其體內(nèi)保護(hù)酶活性均升高，這與Zhou等(2019)研究白背飛虱Sogatellafurcifera經(jīng)殺蟲(chóng)劑處理后其體內(nèi)保護(hù)酶活性變化結(jié)果一致，該結(jié)果進(jìn)一步證明了保護(hù)酶活性與蟲(chóng)體的抗藥性有關(guān)。其中蟲(chóng)螨腈處理后，兩種薊馬體內(nèi)僅CAT活性顯著升高，而經(jīng)唑蟲(chóng)酰胺處理后兩種薊馬體內(nèi)3種保護(hù)酶活性均顯著升高，進(jìn)一步解釋了唑蟲(chóng)酰胺對(duì)兩種薊馬的毒力小于對(duì)蟲(chóng)螨腈的毒力，這與毒力測(cè)定結(jié)果一致。高CO2濃度和殺蟲(chóng)劑對(duì)西花薊馬和花薊馬雙重脅迫時(shí)，兩種薊馬體內(nèi)保護(hù)酶活性均高于僅用殺蟲(chóng)劑處理后兩種薊馬體內(nèi)的保護(hù)酶活性(表3-5)。說(shuō)明高CO2濃度對(duì)殺蟲(chóng)劑脅迫下的兩種薊馬體內(nèi)保護(hù)酶活性有加性效應(yīng)。西花薊馬體內(nèi)保護(hù)酶活性始終顯著高于花薊馬體內(nèi)保護(hù)酶活性，說(shuō)明在逆境脅迫下，西花薊馬應(yīng)激反應(yīng)及適應(yīng)性均強(qiáng)于本地種花薊馬。

昆蟲(chóng)CarE, GST, CYP450和AChE對(duì)維持昆蟲(chóng)體內(nèi)正常的生理生化代謝具有重要意義(孟琳欽等, 2019)，主要參與殺蟲(chóng)劑的代謝抗性。本研究中僅800 μL/L CO2處理西花薊馬和花薊馬時(shí)，兩種薊馬體內(nèi)CarE, GST和AChE活性均升高(圖1, 2和4)，該結(jié)果與Cao等(2021)研究西花薊馬和黃胸薊馬在高CO2濃度下其體內(nèi)解毒酶活性變化一致；經(jīng)高CO2濃度或殺蟲(chóng)劑單一因素處理或兩者交互作用均對(duì)薊馬體內(nèi)CYP450活性沒(méi)有顯著影響(表6； 圖3)，我們推測(cè)CYP450可能沒(méi)有參與西花薊馬和花薊馬對(duì)高CO2濃度和殺蟲(chóng)劑(蟲(chóng)螨腈、唑蟲(chóng)酰胺)脅迫的響應(yīng)。僅用殺蟲(chóng)劑處理薊馬時(shí)，兩種薊馬體內(nèi)GST和AChE活性均升高(圖2和4)，Nazar等(2020)用蟲(chóng)螨腈汏選扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis抗性品系時(shí)，隨著處理代數(shù)的增加其體內(nèi)GST和AChE活性逐步升高，該現(xiàn)象與本研究結(jié)果類(lèi)似。而經(jīng)兩種殺蟲(chóng)劑處理后，西花薊馬體內(nèi)CarE活性表現(xiàn)為抑制，而花薊馬體內(nèi)CarE活性則增強(qiáng)(圖1)，表明西花薊馬對(duì)蟲(chóng)螨腈和唑蟲(chóng)酰胺產(chǎn)生抗藥性可能與CarE活性被抑制有關(guān)，其具體機(jī)制有待下一步研究。西花薊馬和花薊馬在高CO2濃度和殺蟲(chóng)劑雙重脅迫時(shí)，兩種薊馬體內(nèi)解毒酶活性均高于僅用殺蟲(chóng)劑處理后兩種薊馬體內(nèi)的解毒酶活性(圖1-4)，但是毒力測(cè)定結(jié)果表明高CO2濃度下，兩種薊馬對(duì)殺蟲(chóng)劑更敏感，原因可能是薊馬在受到雙重脅迫時(shí)，需要更多的解毒酶去代謝大量毒素，而解毒酶的合成需要消耗能量(Riveroetal., 2011)，根據(jù)能量權(quán)衡假說(shuō)，減少了其他生物功能(如生長(zhǎng)發(fā)育等)可用能量，或通過(guò)更多的取食來(lái)補(bǔ)充能量，從而攝入更多的殺蟲(chóng)劑，加速薊馬的死亡。西花薊馬體內(nèi)解毒酶活性普遍高于花薊馬體內(nèi)解毒酶活性，說(shuō)明在應(yīng)對(duì)不良環(huán)境時(shí)，西花薊馬對(duì)外源或內(nèi)源毒素的代謝能力強(qiáng)于本地種花薊馬。本研究?jī)H測(cè)定了CO2濃度倍增條件下西花薊馬和花薊馬對(duì)兩種殺蟲(chóng)劑的直接生理響應(yīng)，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。