范小雪, 隆 琦, 孫明會(huì), 郭意龍, 趙浩東, 宋岳梅,康育欣, 顧小雨, 陳大福,2,*, 郭 睿, 2,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所, 福州 350002)

非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)起初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程的“噪音”和副產(chǎn)物，不具有任何生物學(xué)功能(Kaikkonen and Adelman, 2018)。但隨著組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步和相關(guān)研究的不斷深入，ncRNA被證實(shí)在動(dòng)植物和微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用(Quinn and Chang, 2016)。ncRNA根據(jù)長(zhǎng)度可分為長(zhǎng)度較長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和長(zhǎng)度較短的小ncRNA，后者可進(jìn)一步分為小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)、微小RNA(microRNA, miRNA)和Piwi蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA, piRNA)等。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期聯(lián)用基于鏈特異性cDNA建庫(kù)的RNA-seq與small RNA-seq(sRNA-seq)技術(shù)對(duì)意大利蜜蜂Apismelliferaligustica7日齡和10日齡工蜂中腸進(jìn)行測(cè)序，并系統(tǒng)解析了意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程的ncRNA差異表達(dá)譜和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及差異表達(dá)ncRNA的調(diào)控作用(郭睿等, 2018a, 2018b; 熊翠玲等, 2018; 杜宇等, 2020a, 2020b)。

piRNA較miRNA(長(zhǎng)度約為22～24 nt)和siRNA(長(zhǎng)度約為20～25 nt)稍長(zhǎng)，且3′末端含有2′-O-甲基修飾位點(diǎn)，可與Argonaute蛋白的亞族蛋白之一的PIWI蛋白家族相互作用形成piRNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(piRNA-induced silencing complex, piRISC)。較多的研究表明piRNA在生殖干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、DNA完整性維持、表觀遺傳學(xué)調(diào)控及物種的性別決定等方面發(fā)揮重要作用(Daietal., 2020)。近十多年來，piRNA在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Aravinetal., 2001)、人Homosapiens(Girardetal., 2006)、小鼠Musmusculus(Aravinetal., 2006)等昆蟲、哺乳動(dòng)物中被陸續(xù)鑒定出來。雖然piRNA的首次發(fā)現(xiàn)是在黑腹果蠅的生殖腺中(Aravinetal., 2001)，但與脊椎動(dòng)物相比，昆蟲的piRNA研究十分滯后。piRNA能以一種類似于miRNA的方式通過與靶mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)調(diào)控靶基因表達(dá)，Kotelnikov等(2009)研究發(fā)現(xiàn)piRNA能與Aub結(jié)合形成piRNA-Aub，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平特異性降解黑腹果蠅Stellate的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Stellate的沉默。

近期的研究結(jié)果表明昆蟲piRNA與抗病毒免疫過程密切相關(guān)(Kolliopoulouetal., 2019)，蜜蜂的內(nèi)源性小RNA(small RNA, sRNA)研究迄今仍比較有限且主要集中在miRNA(Cristinoetal., 2014)，piRNA相關(guān)研究尤為匱乏。目前，piRNA調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育的研究缺失，中腸發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制不明。本研究基于已獲得的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)piRNA進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組范圍的鑒定和分析，進(jìn)而篩選出中腸發(fā)育過程的差異表達(dá)piRNA(differentially expressed piRNA, DEpiRNA)并進(jìn)行靶向預(yù)測(cè)及分析，以期豐富西方蜜蜂的piRNA信息，并為探明piRNA調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

實(shí)驗(yàn)用意大利蜜蜂工蜂取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)教學(xué)蜂場(chǎng)。

1.2 sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)來源

前期研究中，筆者所在團(tuán)隊(duì)已利用sRNA-seq技術(shù)對(duì)意大利蜜蜂7日齡(Am7)和10日齡(Am10)工蜂中腸進(jìn)行測(cè)序，獲得了高質(zhì)量的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)，質(zhì)控結(jié)果顯示經(jīng)sRNA-seq后Am7和Am10分別測(cè)得13 511 614條和13 448 175條原始讀段(raw reads)，過濾后分別得到13 119 002條和13 010 751條有效讀段(clean reads)，兩組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)間的Pearson相關(guān)性分別達(dá)到0.9870和0.9988以上(杜宇等, 2020a)。原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得BioProject號(hào)為PRJNA408312。高質(zhì)量的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)可為本研究中piRNA的鑒定和分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1.3 piRNA的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及分析

首先將上述clean reads比對(duì)西方蜜蜂參考基因組(Assembly Amel_4.5)，獲得能比對(duì)上參考基因組的clean reads即mapped reads，然后按照以下步驟過濾其他類型的sRNA并預(yù)測(cè)piRNA：(1)通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)濾除rRNA, scRNA, snoRNA, snRNA和tRNA等類型的非編碼小RNA；(2)進(jìn)一步濾除剩余clean reads中的miRNA；(3)根據(jù)piRNA的長(zhǎng)度特征，保留長(zhǎng)度介于24～33 nt的sRNA；考慮到部分sRNA比對(duì)基因組時(shí)會(huì)出現(xiàn)同時(shí)比對(duì)到多個(gè)不同位置的情況，因此進(jìn)一步濾除比對(duì)到多個(gè)位置的sRNA，僅保留比對(duì)到唯一位置的sRNA作為候選piRNA。 根據(jù)TPM(tags per million)法(TPM=T×106/N，T表示piRNA的clean reads，N表示總sRNA的clean reads)對(duì)Am7和Am10組中piRNA的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。采用GraphPad Prism 7軟件分析各組中piRNA的結(jié)構(gòu)特征并繪圖。

1.4 DEpiRNA的篩選及靶向分析

按照|log2fold change|≥1且P≤0.05的標(biāo)準(zhǔn)，篩選Am7vsAm10比較組的DEpiRNA。使用TargetFinder軟件(Allenetal., 2005)預(yù)測(cè)DEpiRNA的靶mRNA，采用軟件默認(rèn)參數(shù)。利用BLAST工具將DEpiRNA的靶mRNA比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.geneontology.org)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.genome.jp/kegg/)以獲得功能和通路注釋，根據(jù)上述DEpiRNA與mRNA的靶向結(jié)合關(guān)系，通過Cytoscape軟件(Smootetal., 2011)進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.5 piRNA的Stem-loop RT-PCR驗(yàn)證

利用FastPure?Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2(Vazyme公司，南京)分別提取意大利蜜蜂7日齡和10日齡工蜂中腸樣品的總RNA，3只中腸作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。利用超微量分光光度儀(Thermo Fisher，美國(guó))測(cè)定RNA質(zhì)量。隨機(jī)選取Am7和Am10兩組共有的6個(gè)piRNA(piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)上述piRNA的核酸序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性Stem-loop引物和上游引物(F)以及通用下游引物(R)，委托上海生物工程有限公司合成引物(表1)。參照HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書(Vazyme公司，南京)利用Stem-loop引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為piRNA的PCR模板，利用隨機(jī)引物和oligo (dT)引物進(jìn)行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA作為內(nèi)參基因U6 snRNA(GenBank登錄號(hào): 725641)的PCR模板。PCR反應(yīng)體系(20 μL): PCR Mix(Vazyme公司，南京)10 μL, 上游引物(2.5 pmol/μL) (F) 1 μL,通用下游引物(2.5 pmol/μL) (R) 1 μL, cDNA模板1 μL, DEPC處理水7 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 55℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。采用凝膠圖像成像分析系統(tǒng)(上海培清)進(jìn)行凝膠觀察和拍照。

1.6 DEpiRNA的RT-qPCR驗(yàn)證

參照筆者所在團(tuán)隊(duì)前期已建立的方法(杜宇等, 2020a)，隨機(jī)挑選6個(gè)DEpiRNA(piR-ame-1084826, piR-ame-11093, piR-ame-14476, piR-ame-24995, piR-ame-39500和piR-ame-774987)進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，U6作為內(nèi)參基因(GenBank登錄號(hào): 725641)。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司，南京)對(duì)1.5節(jié)中7日齡和10日齡工蜂中腸樣品的總RNA進(jìn)行Stem-loop反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，作為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)按照SYBR Green Dye試劑盒(Vazyme公司，南京)操作說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Green Dye 10 μL, cDNA模板1.3 μL, 正反向引物(2.5 pmol/μL)各1 μL, DEPC水6.7 μL。反應(yīng)在ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))上進(jìn)行，反應(yīng)程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。3只中腸作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)反應(yīng)均進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，引物信息見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算piRNA相對(duì)表達(dá)量。最后利用Graph Prism 7軟件對(duì)qPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行Student氏t檢驗(yàn)、計(jì)算組間差異顯著性及繪圖。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 意大利蜜蜂工蜂中腸piRNA的數(shù)量與結(jié)構(gòu)特征

意大利蜜蜂7日齡(Am7)和10日齡(Am10)工蜂中腸的sRNA組學(xué)數(shù)據(jù)中濾除rRNA, scRNA, snoRNA, snRNA, tRNA和miRNA后的piRNA長(zhǎng)度分布介于24～33 nt，Am7組中分布在24～30 nt范圍的piRNA數(shù)量高于Am10組的，但分布在31～33 nt的piRNA數(shù)量低于Am10組的(圖1)；其中在Am7組和Am10組中共鑒定到596個(gè)piRNA。

Am7中長(zhǎng)度介于24～29 nt的piRNA的首位堿基主要偏向U，長(zhǎng)度介于30～32 nt的piRNA首位堿基主要偏向于G，而長(zhǎng)度為33 nt的piRNA首位堿基主要偏向A(圖2: A)；Am10中長(zhǎng)度介于24～25 nt的piRNA的首位堿基主要偏向A，長(zhǎng)度介于26～29 nt的piRNA首位堿基主要偏向C，而長(zhǎng)度介于30～32 nt的piRNA的首位堿基主要偏向G(圖2: B)。

圖2 意大利蜜蜂Am7(A)和Am10(B)中腸中piRNA的首位堿基偏向性Fig. 2 Bias of the first base of piRNAs in the midgut of Am7 (A) and Am10 (B) of Apis mellifera ligustica

2.2 意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程DEpiRNA的靶mRNA

在Am7vsAm10比較組中共篩選出41個(gè)DEpiRNA，包括1個(gè)上調(diào)piRNA(piR-ame-1233597, log2fold change=1.767,P=4.38E-03)和40個(gè)下調(diào)piRNA，其中下調(diào)幅度最大的piRNA為piR-ame-1008436(log2fold change=-15.234,P=1.57E-05)，其次為piR-ame-24995(log2fold change=-14.99,P=8.57E-06)和piR-ame-638412(log2fold change=-14.86,P=1.65E-04)。

靶向預(yù)測(cè)結(jié)果顯示僅piR-ame-11093(log2fold change=-13.91,P=9.23E-06), piR-ame-1111451(log2fold change=-13.15,P=9.80E-07), piR-ame-190949(log2fold change=-1.63,P=0.0069)和piR-ame-932156(log2fold change=-1.54,P=0.0089)可分別靶向1 195, 1 018, 4 040和1 063條mRNA，其余piRNA未預(yù)測(cè)到靶mRNA。

GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示上述4個(gè)piRNA的靶mRNA可注釋到細(xì)胞進(jìn)程(1 440條)、代謝進(jìn)程(1 235條)、單一組織進(jìn)程(1 106條)和生物學(xué)調(diào)控(421條)等18個(gè)生物學(xué)過程相關(guān)功能條目，細(xì)胞(631條)、細(xì)胞組件(631條)和細(xì)胞膜(626條)等17個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，結(jié)合(1 482條)、催化活性(1 069條)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性(184條)等10個(gè)分子功能相關(guān)條目，共計(jì)45個(gè)功能條目(圖3)。

圖3 意大利蜜蜂Am7 vs Am10比較組中腸中差異表達(dá)piRNA(DEpiRNA)的靶mRNA的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig. 3 GO database annotation of mRNAs targeted by differentially expressed piRNAs (DEpiRNAs) in the midgutof the Am7 vs Am10 comparison group of Apis mellifera ligustica

此外，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示這些靶mRNA可注釋到嘌呤代謝(74條)、內(nèi)吞作用(55條)、吞噬體(49條)及Hippo信號(hào)通路(59條)等45條通路(圖4)。

圖4 意大利蜜蜂Am7 vs Am10比較組中腸中差異表達(dá)piRNA(DEpiRNA)的靶mRNA的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig. 4 KEGG database annotation of mRNAs targeted by differentially expressed piRNAs (DEpiRNAs) in the midgutof the Am7 vs Am10 comparison group of Apis mellifera ligustica

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，piR-ame-190949的25條靶mRNA涉及發(fā)育相關(guān)的Hippo, Hedgehog, FoxO, Wnt和Notch信號(hào)通路，免疫相關(guān)的泛素介導(dǎo)的蛋白水解(ubiquitin-mediated proteolysis)及MAPK, Jak-STAT和Toll-like受體信號(hào)通路(圖5)；piR-ame-11093的13條靶mRNA涉及Hippo, Hedgehog和Wnt信號(hào)通路及泛素介導(dǎo)的蛋白水解、Toll和Imd信號(hào)通路(圖5)；piR-ame-1111451的16條靶mRNA涉及Hippo和Hedgehog信號(hào)通路及泛素介導(dǎo)的蛋白水解(圖5)；piR-ame-932156的5條靶mRNA涉及Hippo和Wnt信號(hào)通路及泛素介導(dǎo)的蛋白水解(圖5)。

圖5 意大利蜜蜂Am7 vs Am10比較組中腸中差異表達(dá)piRNA(DEpiRNA)及其靶mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Regulatory networks between differentially expressed piRNAs (DEpiRNAs) in the midgut of the Am7 vs Am10comparison group of Apis mellifera ligustica and its target mRNAA: 涉及發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路的DEpiRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) DEpiRNA-mRNA regulatory network in development-related signaling pathways; B: 涉及免疫相關(guān)信號(hào)通路的DEpiRNA-mRNA關(guān)系網(wǎng)絡(luò) DEpiRNA-mRNA regulatory network in immune-related signaling pathways. 藍(lán)色六邊形代表信號(hào)通路，綠色菱形代表DEpiRNA，紅色矩形代表靶mRNA，六邊形、菱形和矩形的大小分別代表連接信號(hào)通路、DEpiRNA和mRNA的數(shù)量。Blue hexagons indicate signaling pathways, green rhombuses indicate DEpiRNA, and red rectangles indicate target mRNA. The sizes of hexagons, rhombuses, and rectangles represent the numbers of signaling pathway, DEpiRNAs and mRNAs, respectively.

2.3 意大利蜜蜂工蜂中腸piRNA的Stem-loop RT-PCR驗(yàn)證

利用Stem-loop RT-PCR對(duì)隨機(jī)選擇的Am7與Am10兩組共有的6個(gè)piRNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在7日齡和10日齡意大利蜜蜂工蜂中腸中均擴(kuò)增出符合預(yù)期大小(約28 bp)的目的片段(圖6)，證明了piRNA表達(dá)的真實(shí)性。

圖6 隨機(jī)選擇的意大利蜜蜂Am7和Am10中腸中共有的6個(gè)piRNA表達(dá)的Stem-loop RT-PCR驗(yàn)證Fig. 6 Stem-loop RT-PCR validation of expression of six randomly selected piRNAs sharedin the midgut of Am7 and Am10 of Apis mellifera ligustica

2.4 意大利蜜蜂工蜂中腸DEpiRNA的RT-qPCR驗(yàn)證

RT-qPCR結(jié)果顯示7個(gè)DEpiRNA中的6個(gè)的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序數(shù)據(jù)中的變化趨勢(shì)一致(圖7)，證實(shí)了本研究中sRNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性和piRNA差異表達(dá)譜趨勢(shì)的真實(shí)性。

圖7 意大利蜜蜂Am7 vs Am10比較組中腸中差異表達(dá)piRNA(DEpiRNA)的RT-qPCR驗(yàn)證Fig. 7 RT-qPCR verification of differentially expressed piRNAs (DEpiRNAs) in the midgutof the Am7 vs Am10 comparison group of Apis mellifera ligustica圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示兩組之間表達(dá)量的差異顯著性 (*P<0.05; **P<0.01)(Student氏t檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisks above bars indicate significance of difference in the expression level between the two groups (*P<0.05; **P<0.01)(Student’s t-test).

3 討論

Liao等(2010)在西方蜜蜂中成功鑒定并克隆了piRNA生物合成通路的兩個(gè)關(guān)鍵基因Am-aub和Am-ago3，首次證實(shí)西方蜜蜂中真實(shí)存在piRNA合成機(jī)制。Wang等(2017)曾通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂雄蜂體內(nèi)存在大量長(zhǎng)度介于26～31 nt的piRNA，并發(fā)現(xiàn)雄蜂體內(nèi)piRNA的表達(dá)豐度和多樣性明顯高于雌性的蜂王和工蜂的。但蜜蜂的piRNA研究迄今仍非常有限。本研究基于已獲得的sRNA-seq數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法從意大利蜜蜂7日齡和10日齡工蜂中腸中共鑒定到596個(gè)piRNA。鑒于目前蜜蜂的piRNA信息匱乏，本研究鑒定到的piRNA很好地豐富了西方蜜蜂的piRNA信息，為進(jìn)一步開展相關(guān)功能研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。推測(cè)上述piRNA在意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程發(fā)揮調(diào)控作用。

piRNA在物種間具有高度保守性，主要體現(xiàn)在長(zhǎng)度分布和堿基偏向性(Ramat and Simonelig, 2020)。piRNA的長(zhǎng)度分布主要介于21～31 nt，例如人類胃癌細(xì)胞中鑒定到的piRNA長(zhǎng)度介于25～31 nt之間(夏言, 2019)；黑腹果蠅雌性性腺中鑒定到的piRNA長(zhǎng)度介于23～30 nt之間(Huangetal., 2017)；家蠶Bombyxmori中鑒定到的piRNA長(zhǎng)度介于25～30 nt，其中分布在28～29 nt的piRNA數(shù)量最多(劉曉, 2018)。本研究中，意大利蜜蜂工蜂中腸piRNA的長(zhǎng)度介于24～33 nt，其中分布在24～28 nt長(zhǎng)度范圍內(nèi)的piRNA數(shù)量較多，這與上述物種的piRNA的長(zhǎng)度分布規(guī)律相似，說明不同物種的piRNA的長(zhǎng)度分布具有較高的保守性。迄今為止，在能夠產(chǎn)生piRNA的動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)單鏈簇通過傳統(tǒng)的單向轉(zhuǎn)錄生成piRNA前體是piRNA的主要生成方式，這種在物種間高度穩(wěn)定的生成方式使得piRNA序列特征高度保守，5′末端的首位堿基具有尿嘧啶(U)偏向性。這一偏向性已在小鼠(Aravinetal., 2005)、家蠶(劉曉, 2018)和果蠅(Huangetal., 2017)等動(dòng)物中被證實(shí)。本研究Am7組中長(zhǎng)度介于24～29 nt的piRNA的首位堿基主要偏向U(圖2: A)，為piRNA的首位堿基偏向性提供了又一例證。

piRNA不僅在生殖細(xì)胞中起到靶向抑制轉(zhuǎn)座子進(jìn)而維持基因組穩(wěn)定性的作用，還能夠以一種類似miRNA的方式通過堿基互補(bǔ)配對(duì)抑制靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響諸多重要生物學(xué)過程(Daietal., 2020)。在哺乳動(dòng)物中，piRNA以類似miRNA和siRNA的作用方式介導(dǎo)體細(xì)胞質(zhì)中mRNA的降解(Zhangetal., 2018)。意大利蜜蜂工蜂中腸是物質(zhì)消化和營(yíng)養(yǎng)吸收的主要場(chǎng)所，發(fā)生著活躍的物質(zhì)和能量代謝反應(yīng)。本研究中，在Am7vsAm10比較組中共篩選到41個(gè)DEpiRNA，但其中只有piR-ame-11093(log2fold change=-13.91), piR-ame-1111451(log2fold change=-13.15), piR-ame-190949(log2fold change=-1.63)和piR-ame-932156(log2fold change=-1.54)能夠潛在靶向結(jié)合mRNA，說明多數(shù)DEpiRNA的主要功能可能是維持基因組穩(wěn)定性，少數(shù)DEpiRNA參與基因表達(dá)調(diào)控。前期研究中，筆者所在團(tuán)隊(duì)在Am7vsAm10比較組篩選到112個(gè)DEmiRNA，其中顯著上調(diào)和下調(diào)的miRNA分別靶向7 434和9 559條mRNA(杜宇等, 2020a)。本研究發(fā)現(xiàn)，上述4個(gè)DEpiRNA共靶向結(jié)合7 316條mRNA，可注釋到119個(gè)新陳代謝相關(guān)通路，包括嘌呤代謝(74條)、丙酮酸鹽代謝(27條)、脂肪酸代謝(26條)、粘蛋白型O-聚糖的生物合成(12條)、不飽和脂肪酸生物合成通路(13條)及脂肪酸合成(11條)等7個(gè)物質(zhì)代謝通路(圖4)，說明在意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程中上述4個(gè)DEpiRNA通過潛在調(diào)控靶基因表達(dá)以調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝。昆蟲體內(nèi)存在的復(fù)雜且廣泛的信號(hào)通路參與調(diào)控諸多生命活動(dòng)，其中Wnt, Hippo, FoxO, TGF-beta, mTOR和Notch信號(hào)通路均已被證實(shí)與昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育與器官形成等密切相關(guān)(Ahmad, 2017)。Jak-STAT、Toll-like受體、Imd、JNK和MAPK信號(hào)通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解可參與昆蟲的免疫應(yīng)答(Brutscheretal., 2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，上述4個(gè)DEpiRNA的靶mRNA可注釋到發(fā)育相關(guān)的Hippo, Hedgehog, Wnt, FoxO和Notch信號(hào)通路以及免疫相關(guān)的泛素介導(dǎo)的蛋白水解、MAPK、Jak-STAT、Toll和Imd及Toll-like受體信號(hào)通路(圖5)。這說明上述4個(gè)DEpiRNA通過調(diào)節(jié)以上發(fā)育和免疫相關(guān)通路在意大利蜜蜂工蜂中腸的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

非編碼小RNA在調(diào)控昆蟲發(fā)育方面扮演著重要角色(李灝淼等, 2020; 張衛(wèi)星, 2020; 祝智威等, 2021)。目前，非編碼小RNA調(diào)控蜜蜂發(fā)育的研究總體有限且集中在miRNA方面(張衛(wèi)星, 2020; 祝智威等, 2021)，早期的piRNA研究多集中在生殖細(xì)胞方面(Ozataetal., 2019)，隨后的研究結(jié)果表明piRNA在體細(xì)胞發(fā)育方面也具有關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究首次從意大利蜜蜂工蜂中腸中鑒定到piRNA，為進(jìn)一步深入開展piRNA調(diào)控意大利蜜蜂和其他蜂種腸道發(fā)育的功能和機(jī)制研究提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。作為基因表達(dá)調(diào)控的又一因子，piRNA或許在蜜蜂的級(jí)型分化、職能分工、清理行為和免疫防御等重要生物學(xué)過程發(fā)揮重要作用。

越來越多的研究表明不同類型的ncRNA可通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而相互作用，共同調(diào)控基因表達(dá)和生物學(xué)過程(Songetal., 2017), lncRNA和circRNA均可以通過miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element, MRE)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA，從而減弱miRNA對(duì)靶基因表達(dá)的抑制(Wangetal., 2019)。前期研究中，我們?cè)谝獯罄鄯涔し渲心cAm7vsAm10比較組中篩選出112條DElncRNA和201個(gè)DEcircRNA可分別通過ceRNA機(jī)制靶向112個(gè)DEmiRNA潛在調(diào)節(jié)意大利蜜蜂工蜂中腸的發(fā)育過程(杜宇等, 2020a)。Betting等(2021)研究發(fā)現(xiàn)propiR1在白紋伊蚊Aedesalbopictus的胚胎發(fā)育早期已開始表達(dá)，并通過與piRNA 3′端種子區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)lncRNA(lnc027353)的降解，進(jìn)而影響白紋伊蚊的體細(xì)胞的成熟。雖然關(guān)于piRNA調(diào)控基因表達(dá)的研究還比較有限，但鑒于piRNA表現(xiàn)出與miRNA類似的長(zhǎng)度分布特征及哺乳動(dòng)物piRNA靶向結(jié)合mRNA的報(bào)道，lncRNA和circRNA能夠通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合piRNA調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。lncRNA/circRNA-piRNA-mRNA軸是否參與調(diào)控意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程以及背后的分子機(jī)制是非常有趣且值得深入探究的科學(xué)問題。

綜上，本研究從意大利蜜蜂工蜂中腸中鑒定到596個(gè)piRNA，其中的piR-ame-11093, piR-ame-1111451, piR-ame-190949和piR-ame-932156 4個(gè)DEpiRNA共靶向結(jié)合7 316條mRNA，并潛在通過調(diào)控Hippo等發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路以及Jak-STAT等免疫通路參與意大利蜜蜂工蜂中腸的發(fā)育過程。