張麗春 王杰 郭志遠 馬科 黃艷 白海棟 劉愛菊 賈躍旗

無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal screening，NIPS) 是一種應(yīng)用高通量測序等分子遺傳學(xué)技術(shù)，檢測孕期母體血漿中胎兒游離DNA片段，以評估胎兒常見染色體非整倍體風(fēng)險的產(chǎn)前篩查技術(shù)，主要目標(biāo)疾病為21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征[1]。同時NIPS也可檢出其他染色體非整倍體(rare autosomal trisomies，RATs)、性染色體非整倍體(sex chromosome aneuploidies，SCAs)及致病性拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)。相對于傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查有更高的準(zhǔn)確性和更低的假陽性率。據(jù)統(tǒng)計NIPS對三種目標(biāo)疾病的檢測準(zhǔn)確率分別達99.4%、97.4%和92.5%，假陽性率分別為0.2%、0.5%和0.8%[2]。引起NIPS假陽性的原因主要包括母體嵌合體、母體腫瘤及雙胎之一消亡或限制性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)[3]。

隨著NIPS的廣泛應(yīng)用，CPM導(dǎo)致的假陽性越來越受到研究者的關(guān)注。CPM指異常細胞系幾乎只存在于胎盤，而未見于羊膜細胞或其他胎兒組織中，即染色體嵌合異常只發(fā)生在胎盤而胎兒染色體正常的現(xiàn)象[4-5]。產(chǎn)生CPM的主要原因是外周血中的游離DNA主要來源于胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞而不是胎兒本身，不能完全代表胎兒的真實情況，造成胎盤和胎兒核型的差異。研究表明CPM可能會改變胎盤功能，導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限、妊娠丟失或圍產(chǎn)兒死亡等[6]。

本研究收集了因NIPS高風(fēng)險在本院進行產(chǎn)前診斷，引產(chǎn)或產(chǎn)后的35例胎盤組織，借助于熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)或基因組拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)技術(shù)對胎盤多個位置進行遺傳學(xué)檢測，并對假陽性病例進行跟蹤隨訪，評估胎盤嵌合對NIPS假陽性及妊娠結(jié)局的影響。

對象與方法

1. 對象：2018年—2020年NIPS檢測結(jié)果高風(fēng)險、在本院行介入性產(chǎn)前診斷、引產(chǎn)或生產(chǎn)后追蹤到胎盤組織的樣本35例。取得受檢者知情同意情況下，對胎盤多個位置行FISH、CMA或CNV-Seq檢測。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會審查批準(zhǔn)(No.2019-007-2)。

2. 胎盤采集方法：選擇自然流產(chǎn)或正常分娩的胎盤，以臍帶為中心點，分別在胎盤母面、胎兒面的中心和邊緣各取1份組織，在近胎盤端采集1份臍帶組織，每份約黃豆大小(長：0.5～1.0 cm，寬：0.5～1.0 cm，深：0.2～0.3 cm)，共采集5份組織標(biāo)本，做好相應(yīng)位點標(biāo)記；對于未收集到完整胎盤的樣本，多點采樣混合后進行檢測。NIPS提示13、16、18、21及22-三體高風(fēng)險樣本行FISH檢測，其他異常選擇CMA或CNV-Seq檢測。

3.檢測方法：

(1)染色體核型分析。在超聲引導(dǎo)下無菌抽取15～20 mL羊水，離心后接種于常規(guī)培養(yǎng)基，收獲細胞、制片、G顯染。鏡下計數(shù)25個分裂相，每個標(biāo)本分析5個核型，如發(fā)現(xiàn)嵌合體，則計算50個分裂相，參照人類細胞基因組學(xué)國際命名體系(ISCN 2020)[7]描述核型。

(2)染色體微陣列分析(CMA)。使用核酸提取試劑盒(美國，Promega 公司)對羊水和組織樣本進行全基因組DNA提取，將提取的DNA樣本用CytoScanTM750K微陣列芯片系統(tǒng)(美國，Affymetrix公司)進行檢測，操作步驟包括酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標(biāo)記、雜交洗滌、掃描和分析等，使用ChAS 4.0軟件對結(jié)果進行分析。參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會的建議[8]評判CNV的臨床意義，參照人類細胞基因組學(xué)國際命名體系(ISCN 2020)[7]描述芯片結(jié)果。

(3)熒光原位雜交檢測(FISH)。將預(yù)處理好的樣品固定于載玻片，并經(jīng)SSC溶液洗滌和胃酶處理將核酸暴露。將載玻片和探針分別在變性劑中變性，載玻片變性后經(jīng)預(yù)冷的乙醇溶液固定、干燥、預(yù)熱；變性后的探針滴于載玻片雜交區(qū)，加蓋蓋玻片，封膠，在封閉的濕盒中過夜雜交。雜交后的載玻片置于變性液中洗滌，再用70%乙醇溶液固定。將洗滌后的載玻片經(jīng)DAPI復(fù)染劑染色，在熒光顯微鏡下鏡檢。鏡下進行細胞計數(shù)并進行結(jié)果判讀。每個雜交區(qū)至少計數(shù)50個信號強度且無重疊的雜交細胞。如大于90%的細胞顯示非整倍體信號，則判定為非整倍體；如10%～60%的細胞顯示非整倍體信號，則可能為嵌合體；如信號差無法確定則加大細胞計數(shù)至100個，參照人類細胞基因組學(xué)國際命名體系(ISCN 2020)[7]描述FISH結(jié)果。

(4)基因組拷貝數(shù)變異測序(CNV-seq)。樣本送檢至深圳華大臨床檢驗中心進行實驗分析。將50 ng基因組DNA進行片段化處理，獲得平均大小為300 bp的DNA片段，構(gòu)建測序文庫，使用BGI-SEQ500基因測序儀(中國，華大基因)進行高通量全基因組測序，應(yīng)用BWA軟件將測序所得序列與GRCh37/hg19基因組進行比對分析，保留唯一定位的Reads；統(tǒng)計校正后1Mb區(qū)域的Reads個數(shù)，并與正常參考數(shù)據(jù)庫進行比較。參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會的建議[8]進行變異解讀，將拷貝數(shù)變異分為五類，即致病(總分≥0.99)、疑似致病(0.90≤總分≤0.98)、臨床意義未明(-0.89≤總分≤0.89)、疑似良性(-0.98≤總分≤-0.90)和良性(總分≤-0.99)。

4.妊娠結(jié)局隨訪與統(tǒng)計：隨訪NIPS假陽性病例妊娠結(jié)局及胎兒發(fā)育情況，用于后續(xù)評估胎盤嵌合對NIPS假陽性及妊娠結(jié)局的影響，NIPS、產(chǎn)前診斷和胎盤檢測結(jié)果的一致率為兩種方法檢測結(jié)果一致的例數(shù)分別在總例數(shù)中的占比。

結(jié)果

1. NIPS、產(chǎn)前診斷、胎盤檢測結(jié)果比較分析：35例NIPS高風(fēng)險的孕婦，NIPS結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果及胎盤檢測結(jié)果進行比較分析(見表1)。35例NIPS高風(fēng)險病例中,NIPS與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致25例，一致率為71.4%(25/35)；10例不一致，為NIPS假陽性；NIPS與胎盤檢測結(jié)果一致29例，一致率為82.9%(29/35)；6例不一致，其中2例NIPS提示CNVs，其NIPS結(jié)果與胎盤檢測結(jié)果異常位置不同。產(chǎn)前診斷結(jié)果與胎盤檢測結(jié)果一致例數(shù)為30例，一致率為85.7%(30/35)。

35例NIPS高風(fēng)險樣本中，常見的T21、T18、T13高風(fēng)險有26例，其產(chǎn)前診斷與NIPS結(jié)果的一致率為84.6%(22/26)，胎盤檢測結(jié)果與NIPS結(jié)果的一致率為92.3%(24/26)。

2. 10例NIPS假陽性病例胎盤檢測及妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果：經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)6例存在CPM(見表2)，CPM占比60%(6/10)。隨訪妊娠結(jié)局及胎兒發(fā)育狀況發(fā)現(xiàn)其中5例孕婦正常妊娠，且胎兒發(fā)育正常，NIPS結(jié)果分別為T21、T13、X單體高風(fēng)險各1例及2例CNVs。其中，T21、T13、X單體高風(fēng)險病例，產(chǎn)前診斷結(jié)果均正常，胎盤檢測結(jié)果顯示NIPS與胎盤異常類型一致。其余2例為CNVs，NIPS結(jié)果分別為dup(2q12.2-q13，5.25M)-M和del(20p12.3-q12.1，9.01M)，產(chǎn)前診斷結(jié)果均正常，胎盤檢測結(jié)果1例為dup(7p14.1p14.1)127.90 kb及dup(Xp22.2p22.2)399.37 kb，另一例為del(7q22.1q22.1)120.57 kb。1例CPM病例引產(chǎn)，NIPS結(jié)果為T6高風(fēng)險，產(chǎn)前診斷結(jié)果為16號染色體存在部分缺失arr[GRCh37]16p13.11(14892975_16528123)×1，胎盤檢測結(jié)果為6號三體嵌合與16p13.11部分缺失，同時產(chǎn)前超聲顯示胎兒宮內(nèi)生長受限，引產(chǎn)。

假陽性中的4例NIPS結(jié)果分別為T21、T18、T4和X單體高風(fēng)險，胎盤結(jié)果均正常，產(chǎn)前診斷結(jié)果3例正常，1例(T4高風(fēng)險)由于孕期羊水少，未進行產(chǎn)前診斷，產(chǎn)后回訪孕婦自述胎兒正常。NIPS提示T4高風(fēng)險病例Z值為12.822，孕期胎兒發(fā)育正常，孕婦36周正常妊娠，胎兒發(fā)育正常，該病例在產(chǎn)后發(fā)現(xiàn)孕婦自身患有胰腺尾部腫瘤。NIPS提示X單體高風(fēng)險病例Z值為12.869，產(chǎn)前診斷明確為假陽性，后對母親外周血核型檢測發(fā)現(xiàn)母親為45，X[10%]/46，XN[90%]嵌合體。其余2例NIPS提示T21高風(fēng)險和T18高風(fēng)險病例Z值分別為-3.611和3.156，產(chǎn)前診斷及胎盤檢測結(jié)果均正常。

表1 35例NIPS高風(fēng)險病例產(chǎn)前診斷及胎盤結(jié)果統(tǒng)計

表2 6例胎盤嵌合病例臨床資料及胎盤結(jié)果

討論

NIPS自2011年應(yīng)用于臨床以來，在產(chǎn)前篩查領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和認可[9]。但是由于NIPS檢測的胎兒游離DNA主要來源于細胞滋養(yǎng)層中胎盤細胞的凋亡，可能會導(dǎo)致NIPS結(jié)果與胎兒的真實情況不一致，造成檢測結(jié)果的假陽性[10]或假陰性[11]。

在造成NIPS假陽性的原因中，胎盤嵌合是重要因素之一[12]。NIPS檢測的胎兒游離DNA絕大部分來源于胎盤滋養(yǎng)層細胞，胎盤滋養(yǎng)層細胞與胎兒都是由同一個合子發(fā)育而來，合子形成后，一部分細胞發(fā)育成胎盤的細胞系，一部分細胞發(fā)育成胎兒的細胞系，通常情況下，兩者的遺傳物質(zhì)相同。Wang等[13]分析了NIPS高風(fēng)險孕婦進行產(chǎn)前診斷的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者中13-三體的符合率為44%，18-三體的符合率為64%，21-三體的符合率為93%，提示胎兒與胎盤的遺傳物質(zhì)可能并非完全相同。本研究統(tǒng)計了NIPS高風(fēng)險病例分別與產(chǎn)前診斷和胎盤結(jié)果的一致率，發(fā)現(xiàn)NIPS與胎盤的一致率為82.9%(29/35)，與產(chǎn)前診斷的一致率為71.4%(25/35)，雖然胎兒與胎盤染色體并非完全相同，但是一致率較高(85.7%)，NIPS對常見染色體非整倍體的檢測效果仍具有重要的參考意義。同時，NIPS結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果存在的偏差提示NIPS出現(xiàn)高風(fēng)險結(jié)果時，建議進行產(chǎn)前診斷的進一步驗證，以排除假陽性和其他染色體異常的存在。

2017年Hartwig等[14]回顧性分析了206例NIPS結(jié)果與胎兒核型不一致病例，發(fā)現(xiàn)假陽性病例182例(88%)，其中60例(33%)分析了假陽性的生物學(xué)或技術(shù)原因，發(fā)現(xiàn)19例(32%)是由CPM導(dǎo)致的，認為CPM是導(dǎo)致假陽性的主要因素之一。本研究的10例NIPS假陽性病例中6例為CPM，CPM占比60%(6/10)，說明CPM是造成NIPS假陽性的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)CPM與宮內(nèi)發(fā)育遲緩、自然流產(chǎn)、宮內(nèi)死亡、死產(chǎn)及胎盤功能異常有關(guān)，可能會導(dǎo)致產(chǎn)前和圍產(chǎn)期不良妊娠結(jié)局[15]。Grati等[16]回顧性分析了124例CPM和468例的正常對照人群，認為只有16-三體會增加CPM的不良妊娠結(jié)局。吳小青等[17]最新研究的5例CPM中，3例(60%)胎兒因生長受限伴或不伴其他超聲異常而被終止妊娠，胎兒生長受限的發(fā)生率明顯高于之前報道，認為CPM與不良妊娠結(jié)局有相關(guān)性的觀點。本研究6例CPM中，隨訪5例妊娠結(jié)局正常，胎兒發(fā)育正常，未出現(xiàn)胎兒生長受限；1例胎兒超聲異常提示胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，其NIPS為T6高風(fēng)險，羊水核型及胎盤檢測均存在16號染色體異常，引產(chǎn)，支持CPM與不良妊娠結(jié)局有相關(guān)性的觀點。因此，對NIPS高風(fēng)險的人群建議進行產(chǎn)前診斷同時密切監(jiān)測胎兒發(fā)育情況。

本研究中對4例NIPS提示性染色體異常的樣本經(jīng)產(chǎn)前診斷后，2例評估為NIPS假陽性的樣本，產(chǎn)后收集到胎盤檢測，發(fā)現(xiàn)其中1例為胎盤嵌合，1例為母體性染色體嵌合。提示母親性染色體異常也可能是導(dǎo)致NIPS假陽性的原因。因此，對于NIPS性染色體異常的孕婦建議檢測母親的染色體核型，以排除母親染色體異常對胎兒正常核型的影響。除此之外，母體罹患腫瘤是導(dǎo)致NIPS假陽性的另一個原因。本研究發(fā)現(xiàn)1例孕期NIPS提示T4高風(fēng)險病例，未進行產(chǎn)前診斷，胎盤檢測結(jié)果正常，跟蹤隨訪，孕婦自述胎兒發(fā)育正常，但在產(chǎn)后發(fā)現(xiàn)孕婦存在胰腺尾部腫瘤，進行了腫瘤切除，推測母親孕期罹患腫瘤可能導(dǎo)致NIPS假陽性。

同時，本研究還發(fā)現(xiàn)2例NIPS假陽性，分別為T21高風(fēng)險和T18高風(fēng)險，通過胎盤檢測未找到假陽性原因，但兩例高風(fēng)險Z值均偏低，分別為-3.611和3.156，推測可能是由于胎盤嵌合程度較低或取樣位置受限。

綜上所述，胎盤嵌合是影響NIPS假陽性的重要原因之一，除此之外，母體染色體異常和母體罹患腫瘤都會導(dǎo)致NIPS假陽性。盡管NIPS的準(zhǔn)確性高于傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查，但由于受胎盤嵌合及母體等多種因素的影響，NIPS的準(zhǔn)確率不能達到100%，無法取代介入性產(chǎn)前診斷。因此，建議選擇NIPS的孕婦均應(yīng)進行檢測前和檢測后遺傳咨詢，包括關(guān)于假陽性風(fēng)險提示；在進行任何不可逆的手術(shù)之前，應(yīng)進行產(chǎn)前診斷來確認或排除胎盤嵌合對胎兒的影響。由于病例數(shù)較少，本研究也存在一定的局限性，為了更全面的揭示NIPS假陽性的原因，還有待于收集更多的病例及臨床數(shù)據(jù)，為CPM及非CPM病例的臨床咨詢提供更充分的依據(jù)。