唐代鈺 董曉靜

胎盤(pán)是連接母胎的重要部分，有屏障作用、物質(zhì)交換、分泌激素、免疫調(diào)控等功能。各種妊娠期母兒疾病均與胎盤(pán)功能密切相關(guān)。涉及到胎盤(pán)的許多研究因倫理問(wèn)題無(wú)法直接在人體開(kāi)展，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果雖有一定參考意義，但又難以全面外推至人體。離體胎盤(pán)灌注模型的提出解決了這一難題。

離體胎盤(pán)灌注模型最早是由Panigel等[1]提出的，通過(guò)灌流管連接供應(yīng)同一胎盤(pán)小葉的臍靜脈與臍動(dòng)脈建立胎兒側(cè)循環(huán)，灌流管插入螺旋動(dòng)脈殘端建立母體側(cè)循環(huán)，主要用于藥物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)研究。后經(jīng)過(guò)Schneider等[2]和Miller等[3]的改進(jìn)，逐漸形成了如下成熟的離體胎盤(pán)灌注模型。

收集胎盤(pán)并進(jìn)行灌洗后，在保留完整胎盤(pán)的基礎(chǔ)上，確定供應(yīng)同一胎盤(pán)小葉的臍靜脈與臍動(dòng)脈，結(jié)扎其分支，穿刺置管建立該小葉的胎兒循環(huán)，當(dāng)臍動(dòng)脈端灌入量與臍靜脈端流出量相等時(shí)說(shuō)明該胎盤(pán)小葉無(wú)滲漏，去除多余的胎盤(pán)組織，在該胎盤(pán)母體側(cè)絨毛間隙內(nèi)插入兩灌流管2～3 mm建立母體循環(huán)。離體胎盤(pán)灌注模型建立后，母體側(cè)灌注液用95%的O2和5%的CO2混合氣體進(jìn)行氧合，胎兒側(cè)則用95%的N2和5%的CO2混合氣體充氣，以模擬母體血與胎兒臍動(dòng)脈血的體內(nèi)狀態(tài)[4]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可通過(guò)測(cè)量胎兒循環(huán)側(cè)pH、溫度、壓力、耗氧量、胎兒凈氧轉(zhuǎn)移、乳酸產(chǎn)量等指標(biāo)來(lái)衡量離體組織活性，但胎兒側(cè)灌注液體積損失測(cè)量則被認(rèn)為是最佳的評(píng)價(jià)指標(biāo)，考慮液體殘留及水分蒸發(fā)，通常胎兒側(cè)灌注液損失量不超過(guò)2～4 mL/min提示該循環(huán)建立成功。安替比林是一種親水性的小分子化合物，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入胎盤(pán)，因此常被作為胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)研究的陽(yáng)性參照物，在母體側(cè)以100%的濃度加入安替比林，灌注2.5 h后安替比林的F/M值>0.75才能說(shuō)明模型建立成功[4]。經(jīng)不斷改進(jìn)后的離體胎盤(pán)灌注模型，被應(yīng)用于藥物與疾病的各方面研究。

一、藥物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)

有研究發(fā)現(xiàn)，約23%～85%的妊娠婦女在妊娠期間需要進(jìn)行藥物治療[5]，但胎盤(pán)屏障作用有限，部分對(duì)胚胎有毒性作用的藥物進(jìn)入母體循環(huán)后可能通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒循環(huán)，從而影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至產(chǎn)生致畸或致死作用。因此，評(píng)估胎兒的藥物暴露水平成為衡量妊娠期用藥安全的重要指標(biāo)。離體胎盤(pán)灌注模型保留了完整的胎盤(pán)結(jié)構(gòu)，是評(píng)估藥物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)的最經(jīng)典的方法。

藥物胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制包括被動(dòng)擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)輸、易化擴(kuò)散、過(guò)濾和胞飲作用。其中被動(dòng)擴(kuò)散是胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要機(jī)制，受物質(zhì)分子量大小、離子化程度、脂溶性高低等因素影響。通過(guò)在開(kāi)放或封閉離體胎盤(pán)灌注系統(tǒng)中進(jìn)行藥物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分藥物以被動(dòng)擴(kuò)散形式通過(guò)胎盤(pán)屏障進(jìn)入母胎循環(huán)，例如抗病毒藥物替諾福韋[6]、阿昔洛韋[7]，內(nèi)分泌用藥溴隱亭[8]等。這些被動(dòng)擴(kuò)散物質(zhì)游離與結(jié)合狀態(tài)的平衡很大程度上影響其經(jīng)胎盤(pán)的運(yùn)輸，故而母體側(cè)血清白蛋白與胎兒側(cè)血清白蛋白濃度是該類物質(zhì)經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要限制因素。例如溴隱亭與母體側(cè)蛋白結(jié)合率高，其分子量較大，研究顯示只有微量溴隱亭通過(guò)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)，其胎兒轉(zhuǎn)移率約6%[8]。而Lee等[9]的研究則表明，降糖藥物二甲雙胍的胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)是由OCT3(organic cation transporter)介導(dǎo)的。Kurosawa等[10]和Freriksen等[11]通過(guò)采集不同藥物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)的數(shù)據(jù)結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)模型分析以及hutson等[12]進(jìn)行的一項(xiàng)meta分析(n=26)均表明，離體胎盤(pán)灌注模型進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與臨床觀察臍血中相關(guān)藥物數(shù)據(jù)高度一致，這表明離體胎盤(pán)灌注模型是研究藥物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)的理想模型。

既往研究證實(shí)，萬(wàn)古霉素[13]、羅格列酮[14]、人胰島素[15]、溴隱亭[8]等藥物極少甚至不透過(guò)胎盤(pán)，在孕期使用有較高的安全性；而縮宮素即使在低于生理濃度的條件下，仍可以由母體側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒側(cè)[16]，故在臨床上使用縮宮素進(jìn)行催產(chǎn)時(shí)，應(yīng)以與生理分娩進(jìn)展速率相適應(yīng)的最低劑量給藥；西地那非是一種通過(guò)增強(qiáng)一氧化氮(NO)途徑介導(dǎo)血管舒張的藥物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其可通過(guò)改善子宮胎盤(pán)血供從而改善子癇前期母胎結(jié)局[17]，但在一項(xiàng)大型臨床實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，西地那非的應(yīng)用可能導(dǎo)致一些新生兒疾病甚至新生兒死亡[18]，后利用體外胎盤(pán)灌注證實(shí)，西地那非可通過(guò)健康婦女胎盤(pán)，且在子癇前期婦女胎盤(pán)中，越早孕周西地那非透過(guò)胎盤(pán)的劑量越大[14]。這些結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)西地那非的臨床用藥有很大參考價(jià)值。

二、毒物經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)

甲醛是常見(jiàn)的家居污染物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)暴露于甲醛的小鼠均出現(xiàn)了生殖系統(tǒng)損害以及胎兒畸形[19]和胎盤(pán)損傷[20]，人離體胎盤(pán)灌注模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甲醛從母體側(cè)經(jīng)胎盤(pán)迅速轉(zhuǎn)移至胎兒側(cè)，通過(guò)與蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等多種生物分子代謝并發(fā)生反應(yīng)，引起DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而在胎盤(pán)和胎兒組織中積累，造成胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞層出現(xiàn)氧化應(yīng)激樣反應(yīng)，導(dǎo)致胎盤(pán)功能障礙[21]。對(duì)羥基苯甲酸酯是一類廣泛用于日常用品的防腐劑，存在潛在的內(nèi)分泌干擾作用，孕期苯甲酸酯的暴露可能導(dǎo)致胎兒體重過(guò)度增長(zhǎng)[22]，而體外胎盤(pán)實(shí)驗(yàn)則證實(shí)，不同種類苯甲酸酯以及不同濃度苯甲酸酯經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)無(wú)明顯運(yùn)輸動(dòng)力學(xué)差異[23]，但其對(duì)胎兒的影響仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。草甘膦是眾多除草劑的有效成分，既往也被認(rèn)為是除草劑毒性的主要成分，但在離體胎盤(pán)模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以草甘膦為基礎(chǔ)的復(fù)方農(nóng)藥比單獨(dú)的草甘膦對(duì)胎盤(pán)循環(huán)和其完整性有更嚴(yán)重的損害，這些復(fù)方農(nóng)藥的配方里含有聚氧乙醇胺、多環(huán)芳烴或重金屬等，這可能是其對(duì)胎盤(pán)毒性高于單獨(dú)草甘膦的原因，這也解釋了暴露于不含草甘膦的殺蟲(chóng)劑或其他環(huán)境污染物的孕婦亦出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的原因[24]。因此，僅以草甘膦作為除草劑毒性所在的說(shuō)法有待商榷。大量研究表明，空氣污染與不良妊娠結(jié)局之間存在一定關(guān)聯(lián)，但對(duì)于污染顆粒毒性背后機(jī)制以及是否能穿過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒循環(huán)仍未可知。Bongaerts等[25]利用離體胎盤(pán)灌注模型進(jìn)行柴油尾氣顆粒(diesel exhaust particles,DEPs)的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)6 h灌注后，DEPs的胎母比值接近于零，在胎兒側(cè)灌注液中沒(méi)有檢測(cè)到明顯DEPs顆粒，但在胎盤(pán)組織，尤其是合胞滋養(yǎng)層中，檢測(cè)到大量DEPs顆粒蓄積，并在胎兒側(cè)上皮細(xì)胞中檢測(cè)到少量DEPs顆粒，表明其毒性作用主要是對(duì)胎盤(pán)功能影響，但該實(shí)驗(yàn)在胎兒側(cè)上皮細(xì)胞檢測(cè)到少量的DEPs，故亦不排除其直接的胎兒毒性作用。氯氰菊酯、唑丙環(huán)唑、比特醇等農(nóng)藥中含有的化學(xué)物品[26]、納米級(jí)粒子[27]等均可通過(guò)胎盤(pán)屏障進(jìn)入胎兒循環(huán)。人離體胎盤(pán)灌注模型是一個(gè)有價(jià)值的研究環(huán)境污染物對(duì)母胎影響的系統(tǒng)，值得在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)研究中得到越來(lái)越多關(guān)注。

三、建立疾病胎盤(pán)模型及研究相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制

妊娠合并癥與并發(fā)癥多通過(guò)影響胎盤(pán)功能從而影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，建立體外的胎盤(pán)疾病模型有助于進(jìn)一步研究的開(kāi)展。子癇前期(preeclampsia,PE)是一種嚴(yán)重影響母胎安全的妊娠期高血壓疾病，目前其發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與孕早期胎盤(pán)淺著床以及孕中晚期胎盤(pán)氧化應(yīng)激反應(yīng)高度相關(guān)，建立PE的體外胎盤(pán)模型有助于更加透徹的研究其發(fā)病機(jī)制。對(duì)健康離體胎盤(pán)組織進(jìn)行缺氧灌注后發(fā)現(xiàn)，母體側(cè)及胎兒側(cè)不同炎癥因子、氧化應(yīng)激標(biāo)志物，例如內(nèi)皮素-1(ET-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均有不同水平的升高，很好的模擬了PE的胎盤(pán)炎癥反應(yīng)[28]；通過(guò)對(duì)比PE產(chǎn)婦及正常產(chǎn)婦離體胎盤(pán)的三維血管模型發(fā)現(xiàn)，PE產(chǎn)婦胎盤(pán)血管床體積較正常產(chǎn)婦減少，1～3級(jí)靜脈和2～3級(jí)動(dòng)脈管徑變小，外周動(dòng)靜脈比增高，這可能是導(dǎo)致PE胎盤(pán)灌注不足的原因之一[29]。PE離體胎盤(pán)微囊泡結(jié)合的一氧化氮合酶(STBEV-eNOS)水平較低導(dǎo)致NO減少[30]，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCA通道)的表達(dá)下調(diào)[17]都可能是導(dǎo)致胎盤(pán)血管收縮的原因。從PE離體胎盤(pán)分離的微囊泡(STBEV)能導(dǎo)致血小板的活化[31]，這可能是PE患者血液高凝的原因。妊娠期糖尿病可能導(dǎo)致早期流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒畸形、巨大兒等不良妊娠結(jié)局，在高糖灌注液模擬的妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)胎盤(pán)模型中，發(fā)現(xiàn)胎兒血管阻力顯著增加，同時(shí)檢測(cè)到內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和蛋白激酶(Akt)磷酸化水平降低，這一結(jié)果提示高糖通過(guò)降低NO的生成，導(dǎo)致血管阻力升高[32]。被瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞表面表達(dá)惡性瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞膜蛋白1(PfEMP1)，介導(dǎo)細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞和合胞滋養(yǎng)細(xì)胞的粘附，從而逃避循環(huán)和免疫，VAR2CSA作為PfEMP1家族的一員，與硫酸軟骨素A(chondroitin sulfuric A,CSA)結(jié)合，從而在體外胎盤(pán)灌注模型中積累，其分布與自然感染相似，而可溶性CSA和抗VAR2CSA抗體抑制了感染紅細(xì)胞的結(jié)合[33]，這一發(fā)現(xiàn)為胎盤(pán)瘧疾疫苗的開(kāi)發(fā)提供了新的研究方案?；诖?，Pehrson等[34]在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，一種脂質(zhì)體制劑中的ID1-ID2a蛋白(目前處于I期試驗(yàn))有效地誘導(dǎo)了抑制胎盤(pán)組織中感染紅細(xì)胞粘附的抗體。在對(duì)胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction,FGR)胎盤(pán)的研究中發(fā)現(xiàn)，吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)的缺乏會(huì)導(dǎo)致色氨酸降解減少，其產(chǎn)生的免疫抑制及胎盤(pán)血管舒張作用減弱[35]，與FGR的發(fā)生密切相關(guān)[36]。FGR也可能與胎兒-胎盤(pán)血管反應(yīng)性改變有關(guān)[37]，在對(duì)比正常胎盤(pán)與FGR胎盤(pán)離體條件下對(duì)前列腺素E2(PGE2)的反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR胎盤(pán)對(duì)PGE2反應(yīng)性較正常組降低[38]，證實(shí)了上述可能。灌注液中加入牛磺膽酸則可建立妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)模型[39]。利用離體胎盤(pán)灌注模型還可建立更多疾病胎盤(pán)模型，以助于更好的進(jìn)行相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。

四、研究相關(guān)治療方案

針對(duì)妊娠期疾病的部分治療措施在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有較好效果，但難以在人體直接開(kāi)展實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，且相關(guān)治療的機(jī)制亦有待明確。例如在PE和正常的離體胎盤(pán)灌注模型的母體灌流液中加入硫酸鎂，PE組可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(sflt-1)濃度較正常對(duì)照組并未增加[40]，提示硫酸鎂對(duì)子癇前期的治療作用僅在于預(yù)防子癇，而與PE相關(guān)的抗血管生成狀態(tài)無(wú)關(guān)。使用編碼VEGF異構(gòu)體的腺病毒(Ad)在動(dòng)物模型中轉(zhuǎn)導(dǎo)子宮動(dòng)脈可以增加子宮-胎盤(pán)血液灌注量(utero-placental blood perfusion,UBF)并改善胎兒在子宮內(nèi)的生長(zhǎng)[41]，但應(yīng)用于人體需驗(yàn)證其安全性，在離體胎盤(pán)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胎兒側(cè)靜脈灌流液中很少檢測(cè)到病毒載體，檢測(cè)到病毒載體時(shí)滴度也非常低[42]，這一結(jié)果為該治療方法應(yīng)用于人體提供了一定的依據(jù)。雙胎輸血綜合征(twin to twin transfusion syndrome,TTTS)的治療十分有限，激光治療是目前較好的辦法，利用離體胎盤(pán)灌注模型研究TTTS激光治療時(shí)相關(guān)因素的影響可為治療細(xì)節(jié)提供更多的指導(dǎo)[43]。干細(xì)胞的移植是治療妊娠期相關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)，體外胎盤(pán)灌注模型是研究間充質(zhì)干細(xì)胞的胎盤(pán)遷移和定植的良好工具，將熒光標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞注入離體胎盤(pán)灌注模型的血管，從胎盤(pán)中將注射后的血管分離、培養(yǎng)、制作切片，可見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮屏障，實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，穿過(guò)血管壁遷移的間充質(zhì)干細(xì)胞仍在血管生態(tài)位內(nèi)，并不遷移至周?chē)M織中，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究明確[44]。

五、離體胎盤(pán)灌注的代謝

進(jìn)入胎盤(pán)的物質(zhì)并非均以原型進(jìn)入胎兒循環(huán)，胎盤(pán)的代謝功能對(duì)于物質(zhì)經(jīng)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)有一定影響。例如雌激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)進(jìn)入胎盤(pán)后，經(jīng)代謝形成活性較高的雌激素及活性較低的ZEN-14-硫酸鹽結(jié)合物釋放入母體和胎兒循環(huán)[45]。皮質(zhì)醇在胎盤(pán)中被11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2)快速代謝為可的松，而皮質(zhì)醇亦會(huì)影響色氨酸在胎盤(pán)中的代謝[46]。吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)是色氨酸(TRP)分解過(guò)程中的一種酶，絨毛膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞和蛻膜螺旋動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞有其定值。IDO1介導(dǎo)的TRP在內(nèi)皮細(xì)胞分解代謝可能產(chǎn)生抗菌活性和免疫抑制，以及胎盤(pán)血管緊張的松弛，從而促進(jìn)胎盤(pán)灌注和胎盤(pán)及胎兒的生長(zhǎng)。但胎盤(pán)中的TRP降解酶也會(huì)導(dǎo)致色氨酸的缺乏，這兩個(gè)過(guò)程的結(jié)合對(duì)建立和維持胎兒-母體免疫耐受具有重要意義[36]。胎盤(pán)對(duì)于不同物質(zhì)的代謝與其含有的特殊的酶及相關(guān)蛋白有關(guān)，離體胎盤(pán)灌注模型可讓研究者更徹底地研究胎盤(pán)的代謝功能。

綜上所述，離體胎盤(pán)灌注模型在研究疾病、藥物、環(huán)境等對(duì)母胎的影響上有很高應(yīng)用價(jià)值。其作為最接近生理?xiàng)l件的模型，是用于研究胎盤(pán)功能最經(jīng)典的方法，但也存在一定的局限。例如實(shí)驗(yàn)中多采用的是妊娠晚期剖宮產(chǎn)或順產(chǎn)的胎盤(pán)，妊娠晚期隨著妊娠進(jìn)展，胎盤(pán)功能逐漸減退，實(shí)驗(yàn)所得出相關(guān)結(jié)果難以完全代表妊娠早期的胎盤(pán)狀況；離體后的胎盤(pán)雖在接近于生理的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，但在例如酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量、胎盤(pán)組織在制備過(guò)程中缺血缺氧所致本身?yè)p傷等方面與體內(nèi)均有一定差異?；诖?，近來(lái)有學(xué)者將離體胎盤(pán)灌注與數(shù)學(xué)建模相結(jié)合[47]，進(jìn)一步明確胎盤(pán)灌注系統(tǒng)的各種實(shí)驗(yàn)條件控制及相關(guān)影響因素，這使得研究者可更加便利地模擬各種條件下胎盤(pán)功能的研究。盡管離體胎盤(pán)灌注存在一定不足，但作為目前研究胎盤(pán)功能最經(jīng)典的方法，仍然是眾多研究者的選擇，在今后的研究中，可對(duì)影響離體胎盤(pán)灌注的各項(xiàng)因素進(jìn)行更深入的了解，以提供更加接近體內(nèi)環(huán)境的離體胎盤(pán)灌注模型。