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        包頭地區(qū)漢族人群ESR2基因SNP rs4986938多態(tài)性與弱精子癥相關(guān)性研究

        2022-07-13 00:20:48李得春王艷國吳滌
        中國生育健康雜志 2022年4期

        李得春 王艷國 吳滌

        隨著社會的發(fā)展和生活環(huán)境的變化,不孕不育已經(jīng)成為了重要的公共衛(wèi)生問題,據(jù) WHO 的統(tǒng)計(jì),全球大約有15%的夫婦受此困擾,其中約40%~56%是由男性原因?qū)е碌牟辉胁挥?,并有持續(xù)增長的趨勢[1-5],其中男性精液質(zhì)量異常屬于主要原因[6]。據(jù)報(bào)道約24%的低生育率與弱精子癥直接相關(guān)[7-9]。目前,認(rèn)為男性低生育率的產(chǎn)生多數(shù)由參與精子發(fā)生過程的相關(guān)基因的突變而導(dǎo)致[10]。研究發(fā)現(xiàn),ESR2基因多態(tài)性與男性不育相關(guān),但眾多學(xué)者研究結(jié)論尚不完全一致,在伊朗人群[11]和日本人群[12]中rs4986938位點(diǎn)的等位基因頻率差異都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在中國臺灣人群[13]中與精液濃度有關(guān),而在中國河南漢族人群[14]中可能與男性不育的發(fā)生相關(guān)。針對男性弱精子癥情況,本研究通過測定中國內(nèi)蒙古包頭地區(qū)弱精男性不育患者ESR2基因rs4986938的多態(tài)性,探討ESR2基因多態(tài)性與弱精子癥男性不育的關(guān)系。

        資料與方法

        1.一般資料:收集包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2018—2019年202名男性就診者資料,由有經(jīng)驗(yàn)的流行病學(xué)專家設(shè)計(jì)統(tǒng)一調(diào)查問卷,由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員逐一詢問獲得詳細(xì)的人口統(tǒng)計(jì)資料及出行方式、睡眠時(shí)間、吸煙、體育鍛煉時(shí)間、工作地點(diǎn)、家裝木地板及板材家具裝修狀況等,其中包括文獻(xiàn)報(bào)道對男性生殖有影響的消毒劑[15]等內(nèi)容。

        2.研究對象確定:選取2018年1月—2019年3月期間于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的弱精癥患者標(biāo)本78例作為弱精組,年齡范圍26~44歲,平均年齡(31.2±4.9)歲。正常精液患者標(biāo)本124例為對照,年齡23~49歲,平均年齡(30.3±5.2)歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。其中至少2次精液常規(guī)分析確定為弱精子癥的入組(參照WHO第5版手冊標(biāo)準(zhǔn))[16]前向運(yùn)動精子(PR)+非前向運(yùn)動精子(NP)< 40% 或 PR< 32%,所有標(biāo)本均排除生殖道感染、精索靜脈曲張、激素水平異常及系統(tǒng)性疾病等。

        3.血樣收集和DNA提?。撼槿§o脈血,置于EDTA抗凝管中,-20℃保存,采用基因組DNA提取試劑盒(天根血液基因組DNA提取試劑盒)提取全血基因組DNA,具體步驟按試劑盒說明書操作。

        4. PCR擴(kuò)增,基因型檢測:PCR擴(kuò)增引物(rs4986938)(F:5′-GGTCCCAGTGTATGACCTGC-3′,R:5′-AAGGTGGAGGGAAGGATGGT-3′)。PCR反應(yīng)體系中含有2.5 μM上游引物1.0 μL,2.5 μM下游引物1.0 μL,DNA 1 uL,TaKaRa LA Taq 0.5 μL,dNTP mixture 2.0 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,加ddH2O至25 uL。PCR反應(yīng)條件為94℃,5 min;94℃,30 sec;60℃,30 sec;72℃,40 sec;循環(huán)35次,最后一次72℃延伸5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。rs4986938位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物片段是291 bp。PCR產(chǎn)物送通用生物技術(shù)有限公司采用Sanger雙脫氧測序法進(jìn)行測序,有三種基因型,即GG、GA、AA。

        5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以百分比表示計(jì)數(shù)資料;各基因型的分布、等位基因頻率的組間比較采用χ2檢驗(yàn),并計(jì)算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI),評估基因突變對該疾病發(fā)生的相對危險(xiǎn)度;非正態(tài)計(jì)量資料用秩和檢驗(yàn);采用Logistic回歸法排除混雜因素,分析ESR2基因型多態(tài)性與弱精子癥男性不育的關(guān)系。

        結(jié)果

        1.一般特征比較:在202例研究對象中,弱精癥患者78名、正常精液男性體檢者124名。χ2檢驗(yàn)顯示,兩組在工作地點(diǎn)和吸煙方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

        弱精組和正常組比較,精子總活力、前向運(yùn)動力、精子活力、精子濃度、前向運(yùn)動精子、非前向運(yùn)動精子、不動精子等指標(biāo)經(jīng)秩和檢驗(yàn)有顯著性差異,見表2。

        表1 研究對象的一般情況比較 [例(%)]

        表2 研究對象的精子情況比較

        2. ESR2基因rs4986938位點(diǎn)PCR產(chǎn)物:下圖是ESR2基因rs4986938位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物,擴(kuò)增片段是291 bp,見圖1。

        圖1 ESR2 rs4986938 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(擴(kuò)增產(chǎn)物291 bp)

        3. ESR2基因rs4986938位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布:ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性有三種基因型,即GG、AG、AA。弱精組ESR2基因rs4986938位點(diǎn)GG基因型頻率為73.1%,低于對照組(87.1%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。弱精組中AA 基因型頻率為5.1%,與對照組(1.6%)無顯著差異。此外,弱精組患者 AG基因型頻率為 21.8%,高于對照組(11.3%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在弱精組中,ESR2 基因rs4986938的A等位基因頻率為16.0%,高G等位基因頻率為84.0%。A等位基因頻率高于對照組(7.3%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表3。

        表3 兩組患者rs4986938位點(diǎn)基因及基因型頻率分布 [例(%)]

        弱精癥雜合子基因測序圖灰色區(qū)域代表突變堿基,見圖2。

        圖2 ESR2基因rs4986938位點(diǎn)雜合子基因測序圖

        4. ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與弱精男性不育的關(guān)系分析結(jié)果:在調(diào)整吸煙、工作地方等影響因素后,GA+AA基因型與GG基因型比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;具有GA和AA基因型者,男性不育的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.41,95%CI:0.20~0.86),結(jié)果見表4。

        表4 ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與弱精男性不育的關(guān)系 [例(%)]

        討論

        男性的優(yōu)勢激素為雄激素,但是男性體內(nèi)雌激素的水平會直接影響雄激素的水平,雌激素主要是通過雌激素受體來實(shí)現(xiàn)其作用[17]。雌激素受體有兩種,ESR1和ESR2。其中ESR2主要分布在睪丸、前列腺、卵巢、松果體、甲狀腺、淋巴組織、尿道中[18-19],研究顯示,ESR2是卵泡發(fā)育和精子發(fā)育過程中的雌激素發(fā)揮功能的介導(dǎo)物[20],所以,ESR2與男性不育相關(guān)研究較多[21-22]。雌激素受體2是由ESR2基因編碼的,ESR2基因定位于14q22-24,全長約40 kb,包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,編碼530個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。ESR2基因rs4986938位點(diǎn)位于ESR2基因的第8外顯子的3′非編碼區(qū)第1730號核苷酸,rs4986938位點(diǎn)由G突變?yōu)锳,因其處于非編碼區(qū),可能會影響ESR2的表達(dá)和功能,進(jìn)而影響雌激素的生理功能[23]。

        本文分析了近年中國內(nèi)蒙古包頭地區(qū)弱精癥男性不育患者的ESR2基因SNPrs4986938多態(tài)性位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)A等位基因頻率顯著高于對照組。本實(shí)驗(yàn)由于AA基因型數(shù)量較少,故將GA基因型與AA基因型數(shù)量合并后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。經(jīng)Logistic回歸分析,GA+AA基因型頻率顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在調(diào)整有影響的混雜因素后,結(jié)果提示GA+AA基因型與GG基因型比較可以降低包頭地區(qū)弱精癥男性的不育風(fēng)險(xiǎn),這與其他學(xué)者的相關(guān)研究有一定的不同。2010年,有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)伊朗人群此位點(diǎn)的等位基因在對照組與病例組中的頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2011年中國臺灣學(xué)者[13]發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)的多態(tài)性與精液濃度有關(guān)。而本文所得結(jié)果可能與種族、生活的環(huán)境以及生活的方式不同等因素造成。另外,本研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),弱精人群和正常組比較戶外和室內(nèi)的工作地點(diǎn)有差異,可能因長期接受紫外線照射可造成DNA的損傷;其次,這可能與包頭是一座重工業(yè)城市有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)每天吸煙大于20支在弱精組和正常組之間有顯著性差異,這與多數(shù)學(xué)者研究相符[24-26]。

        本研究提示,ESR2基因SNPrs4986938位點(diǎn)GA+AA基因型可降低弱精癥男性不育風(fēng)險(xiǎn),ESR2基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性可能與包頭地區(qū)漢族人群中弱精子癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),由于本研究實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限,可能導(dǎo)致本研究結(jié)果具有一定的局限性。更多有利于臨床研究的數(shù)據(jù)還需進(jìn)一步加大樣本量研究并驗(yàn)證,以闡明ESR2基因多態(tài)性在弱精男性不育中的作用機(jī)制,為男性不育提供理論依據(jù)。

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