蔡青照，艾麗梅

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一種形態(tài)上中等至大的B細(xì)胞淋巴瘤，約占全球新診斷淋巴瘤的1/3，是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)中最常見的類型[1]。miRNA是一種長鏈非編碼RNA，通過與下游基因的3′-UTR結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯[2]。研究表明miRNA已經(jīng)成為癌癥進(jìn)展中的重要參與者,可以抑制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等多種生物學(xué)過程中都發(fā)揮重要作用，但miR-409-3p在DLBCL中的研究較少報(bào)道。因此，該研究通過調(diào)節(jié)miR-409-3p在DLBCL細(xì)胞中的表達(dá)，來檢測其對腫瘤細(xì)胞凋亡能力以及Rab10表達(dá)水平的影響，然后進(jìn)一步檢測Rab10在DLBCL和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生(reactive hyperplasia of lymph nodes, RHL)組織中的表達(dá)差異并分析Rab10與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床患者數(shù)據(jù)和細(xì)胞株來源 選取該院初診為DLBCL的患者83例，其中男性35例，女性48例，年齡(61.6±12.7)歲，所有病例術(shù)前均未行放化療或任何其他抗腫瘤治療，所有患者都有完整的臨床和隨訪數(shù)據(jù)。對照組是對同時(shí)段在該院血液科診斷為RHL的20例患者，無任何惡性腫瘤病史，所有患者在參與研究前都必須簽署知情同意書，人DLBCL細(xì)胞株OCI-ly7購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2主要試劑 miR-409-3p mimic、mimic NC、miR-409-3p inhibitor和inhibitor NC購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Lipofectamine3000、Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基和TRIzol購自美國Thermo Fisher科技公司，三氯甲烷和異丙醇購自南京化學(xué)試劑有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒、One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit II (SYBR Green)、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green? qRT-PCR User Manual和TB Green? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) 購自日本 TaKaRa公司，CCK-8和Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Rab10兔抗人多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染OCI-ly7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d，接種細(xì)胞至6孔板中，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到70%～80%。將使用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋過的miRNA和Lipo3000混合，室溫孵育20 min后加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)4～6 h后將孔中含miRNA-lipo3000 混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基，最后將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn) 用TRIzol從轉(zhuǎn)染后收集的細(xì)胞中提取總RNA，在分光光度計(jì)上測量RNA濃度及純度，OD260/OD280在1.8～2.1視為抽提的RNA的純度很高。然后以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA產(chǎn)物，最后通過使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀95 ℃ 5 min×1個(gè)周期，95 ℃、15 s，60 ℃、20 s和72 ℃、40 s×40個(gè)周期,分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，繪制PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線和熔解曲線。數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA或mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中用到的引物見表1。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中使用到的引物

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 分別取空白對照組(control組)、miR-409-3p mimic組、mimic NC組、miR-409-3p inhibitor組和inhibitor NC組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液提取總蛋白，使用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。然后開始配分離膠和濃縮膠，待膠成形后拔掉梳子加入適量蛋白和Marker到上樣孔中，開始電泳。參照預(yù)染Marker的位置，待目的條帶進(jìn)入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)時(shí)，停止電泳，開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用5%脫脂奶粉封閉、TBST洗滌3次后加入一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST洗滌后加入5%脫脂奶粉稀釋后的二抗，反應(yīng)結(jié)束后TBST洗滌最后進(jìn)行蛋白顯影。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞配成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液；將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處每孔的OD值，計(jì)算抑制率，抑制率(%)=(陰性對照組-實(shí)驗(yàn)組)/陰性對照組。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-APC混勻后，加入5 μl 7-AAD，混勻；室溫、避光、反應(yīng)10 min；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的情況。

1.2.6免疫組化(immunohistochemical，IHC)實(shí)驗(yàn) 石蠟切片首先置于60 ℃烤片機(jī)中烘烤40 min，然后經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，枸櫞酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后加入過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min，PBS沖洗，滴加封閉用正常山羊血清室溫孵育20 min,勿洗滴加一抗?jié)窈兄? ℃孵育過夜，次日取出濕盒室溫下復(fù)溫40 min，PBS沖洗，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物孵育20 min，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育20 min，PBS沖洗后滴加新鮮配置的DAB顯色液5 min，自來水沖洗，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，蘇木精染液復(fù)染，鹽酸乙醇分化，最后經(jīng)逆濃度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封固。

1.2.7IHC結(jié)果判定 分別在100倍和200倍顯微鏡下為每個(gè)樣本隨機(jī)選擇了至少3個(gè)高質(zhì)量染色區(qū)域，并由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家以盲法評估載玻片，Rab10的表達(dá)用半定量免疫反應(yīng)性評分 (IRS) 法對染色結(jié)果進(jìn)行評估[3]，每張切片染色深淺程度為：無著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；深棕色，3分。蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞比例為無陽性表達(dá)0分，陽性表達(dá)小于25%記1分，陽性表達(dá)25%～50%記2分，陽性表達(dá)大于50%記3分。最終得分=染色程度得分×蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞比例得分，最終得分≤3分為低表達(dá)，得分>3分為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 OCI-Ly7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-409-3p和Rab10的表達(dá)變化轉(zhuǎn)染mimic NC (t=1.952,P=0.067 8)和inhibitor NC(t=1.179,P=0.099 4)較control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimic后與mimic NC組相比，miR-409-3p的表達(dá)增加(t=24.98,P<0.000 1)；轉(zhuǎn)染miR-409-3p inhibitor 后與inhibitor NC組相比，miR-409-3p的表達(dá)降低(t=28.67，P<0.000 1)。過表達(dá)miR-409-3p后Rab10的mRNA(t=21.54,P<0.000 1)和蛋白(t=13.53,P=0.000 2)表達(dá)量較mimic NC組增加，而沉默miR-409-3p的表達(dá)后Rab10的mRNA(t=12.69,P<0.000 1)和蛋白(t=8.909,P=0.000 9)表達(dá)量較inhibitor NC組則降低(P<0.000 1)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 miR-409-3p的轉(zhuǎn)染效率及對Rab10的影響

2.2 miR-409-3p對OCI-Ly7細(xì)胞增殖的影響過表達(dá)miR-409-3p抑制細(xì)胞生長，吸光度較mimic NC組降低(t=33.44,P<0.000 1)；沉默miR-409-3p促進(jìn)細(xì)胞生長，吸光度較inhibitor NC增加(t=26.30,P<0.000 1)。見圖2。

圖2 miR-409-3p對DLBDL細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miR-409-3p對OCI-Ly7細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimic后細(xì)胞的凋亡率與轉(zhuǎn)染mimic NC組相比增加(t=64.34,P<0.000 1)；轉(zhuǎn)染miR-409-3p inhibitor組的細(xì)胞凋亡率比轉(zhuǎn)染inhibitor NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.579，P=0.001)。見圖3。

圖3 miR-409-3p對DLBDL細(xì)胞凋亡能力的影響

2.4 Rab10在DLBCL和RHL患者組織中的表達(dá)差異Rab10在各種膜結(jié)構(gòu)、囊泡和細(xì)胞骨架中(https://www.uniprot.org/)表達(dá)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，大小形態(tài)不等(圖4)，在DLBCL組織中的高表達(dá)率為 54.2%(45/83),在RHL組織中的高表達(dá)率為25%(5/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)。見表2。

圖4 Rab10在DLBCL和RHL組織中的表達(dá)

表2 Rab10在DLBCL和RHL患者中的表達(dá)[n(%)]

2.5 Rab10的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系高水平的LDH和β2微球蛋白水平以及IPI評分高的患者Rab10表達(dá)量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 Rab10與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

盡管利妥昔單抗時(shí)代到來之后，DLBCL患者的治愈率得到了顯著提高，但仍有20%～30%的患者治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)[4]。miRNA作為一種新的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的多種生物學(xué)功能中都發(fā)揮著重要作用，它通過與下游靶基因的特定序列結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)。有報(bào)道[5]表明在復(fù)發(fā)的DLBCL患者中miR-409-3p的水平下降，miR-409-3p可以促進(jìn)DLBCL細(xì)胞對利妥昔單抗和阿霉素的藥物敏感性，但miR-409-3p對DLBCL細(xì)胞增殖和凋亡能力及機(jī)制研究還未見報(bào)道，該研究使用TargetScan 7.2和miRDB預(yù)測miR-409-3p的下游靶基因，結(jié)果顯示miR-409-3p與Rab10存在互補(bǔ)序列，說明Rab10可能是miR-409-3p的下游靶基因，Rab10可能接受miR-409-3p的調(diào)控。Rab10作為RAS超家族中的成員，是細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。以往的研究[6]主要集中在Rab10在囊泡運(yùn)輸中的作用，近年來Rab10在腫瘤的研究開始得到重視，有研究[7]表明Rab10在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外Rab10在宮頸癌[8]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]和食管鱗狀細(xì)胞癌[10]中都起到致癌基因的作用，但Rab10在DLBCL中表達(dá)和臨床關(guān)系尚不清楚。有研究[11]顯示Rab10在白血病中表達(dá)增加，參與了白血病細(xì)胞的生長；DLBCL是一種起源于血液系統(tǒng)的有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，它的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)與其他血液惡性疾病有許多共通之處，因此，該研究進(jìn)一步分析了Rab10與DLBCL患者的關(guān)系。

該研究首先在細(xì)胞水平上過表達(dá)和沉默miR-409-3p來觀察細(xì)胞生長活性的變化，結(jié)果顯示miR-409-3p能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。這與以往的研究[12]結(jié)果一致，miR-409-3p在絕大多數(shù)腫瘤中都被認(rèn)為是抑癌基因，例如miR-409-3p在宮頸癌、卵巢癌、甲狀腺乳頭狀癌、非小細(xì)胞肺癌等都表現(xiàn)為抑癌作用。進(jìn)一步分析miR-409-3p和Rab10的關(guān)系，表明miR-409-3p對Rab10有促進(jìn)作用。

為了更好地探討Rab10與DLBCL患者的關(guān)系，分別檢測在DLBCL和RHL患者中的Rab10水平，結(jié)果顯示Rab10在DLBCL患者的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步分析Rab10和患者的臨床資料的關(guān)系，表明在高水平的LDH、高水平β2微球蛋白及IPI評分高的患者中Rab10的表達(dá)量都有相對較高的趨勢，LDH水平[13]和IPI評分[14]與淋巴瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，血清β2微球蛋白是影響淋巴瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]，這說明高水平Rab10的DLBCL患者腫瘤負(fù)荷更重、預(yù)后更差，這與以往的研究[16]結(jié)果也是一致的，Rab10在腫瘤患者的表達(dá)升高，與遠(yuǎn)期并發(fā)癥和不良預(yù)后有關(guān)。