祁榮 郭麗

[摘要]目的建立一種用于透射電子顯微鏡超薄切片批量染色的方法。方法采用一次性醫(yī)用注射器作為批量染色工具，在注射器內(nèi)塞的頂端軟橡膠處，用干凈刀片劃出若干平行的裂隙，裂隙間隔4～5 mm，將銅網(wǎng)依次插入，再小心將內(nèi)塞插入針管內(nèi)，在注射器針管內(nèi)完成染色和清洗步驟。結(jié)果一次性醫(yī)用注射器批量染色法和傳統(tǒng)蠟板滴染法都獲得了比較理想的鏡下圖像，其與傳統(tǒng)蠟板滴染法比較，一次性醫(yī)用注射器批量染色法具有染色時(shí)間短、染液用量少、污染少、操作更便捷、對銅網(wǎng)機(jī)械損傷小，和根據(jù)染色銅網(wǎng)數(shù)量選擇不同規(guī)格的注射器等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)論一次性醫(yī)用注射器批量染色法，極大提高了染色效率、大大降低實(shí)驗(yàn)成本，是透射電子顯微鏡超薄切片批量染色的理想方法。

[關(guān)鍵詞]透射電子顯微鏡;超薄切片;批量染色;一次性醫(yī)用注射器

[中圖分類號(hào)] R361.2? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A?? [文章編號(hào)]2095-0616（2022）09-0032-04

Establishment of a batch staining method for ultrathin sections for transmission electron microscopy

QI? Rong??? GUO? Li

Scientific Experiment Center， Shenyang Medical College， Liaoning， Shenyang 110034， China

[Abstract] Objective To establish a batch staining method for ultrathin sections for transmission electron microscopy （TEM）. Methods A disposable medical syringe was used as a batch staining tool， and several parallel slits spaced 4-5 mm apart from each other were scribed with a clean blade at the top of the soft rubber of the inner plug. The copper meshes were inserted into the syringe tube in turn， followed by insertion of the inner plug， and the staining and cleaning procedures for copper meshes were completed in the syringe tube. Results Relatively ideal microscopic images were obtained by both batch staining with disposable medical syringe and traditional drop staining on the wax plate. Compared with the traditional drop staining on the wax plate， batch staining with disposable medical syringe presented the advantages of shorter staining time， less consumption of staining solution， less pollution， more convenient operation， less mechanical damage to the copper meshes， and alternative selection of different specifications of syringes according to the number of stained copper meshes. Conclusion Batch staining with disposable medical syringe greatly improves the staining efficiency and significantly reduces the experimental cost， and is an ideal batch staining method for ultrathin sections for TEM.[Key words] Transmission electron microscopy; Ultrathin sections; Batch staining; Disposable medical syringe

生物樣品制備透射電子顯微鏡超薄切片，越來越多被應(yīng)用在教學(xué)、科研、臨床病理改變分析[1]、疾病診斷[2]、細(xì)胞鑒別[3]等方面。透射電子顯微鏡成像原理：用波長極短的電子束作為照明源，經(jīng)過加速和聚集，對樣品進(jìn)行高能轟擊，使電子與樣品中的原子碰撞，發(fā)生方向的改變，從而產(chǎn)生不同的電子立體角散射，散射力的大小與樣品的密度和厚度相關(guān)，電子穿過超薄樣品后，形成電鏡下明暗不同的灰度反差以及清晰的超微圖像[4-6]。由于生物樣品本身的反差低，需要進(jìn)行重金屬染色[7]，而細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)對重金屬離子的結(jié)合力不同，利用這一特點(diǎn)對其進(jìn)行重金屬染色[8]。優(yōu)質(zhì)的電鏡下圖像與制作樣本的每一個(gè)環(huán)節(jié)都息息相關(guān)[9]，超薄切片的重金屬染色是關(guān)鍵步驟之一[10]，傳統(tǒng)蠟板滴染法的染色過程存在諸多不足，為此，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)出一種批量染色方法，實(shí)現(xiàn)批量染色，使銅網(wǎng)邊緣不被反復(fù)夾持破壞、節(jié)約人力和染液、縮短染色時(shí)間、減少污染，同時(shí)獲得滿意的透射電子顯微鏡超薄切片染色效果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料采用一次性醫(yī)用注射器，規(guī)格是2.5、5、10、20 ml 四種（沈陽市北華醫(yī)材有限公司），銅網(wǎng)（北京新興百瑞公司），電鏡專用消磁鑷子（北京新興百瑞公司），單面刀片（上海吉列有限公司），黑色避光紙，正常大鼠海馬組織。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑2.5%戊二醛（沈陽瑞豐精細(xì)化學(xué)品有限公司），1%鋨酸（美國 PI 公司），氫氧化鈉顆粒（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色法[11]：常用的染色液有兩種，2%醋酸乙醇雙氧鈾染液（美國 PI 公司）和0.1%檸檬酸鉛染液（北京新興百瑞公司）。

1.1.3儀器日立 H-7650型透射電鏡（日本）。

1.2方法

1.2.1制作超薄切片樣品制備流程包括：固定、梯度脫水、浸透、包埋、聚合、修塊、切片和染色等操作步驟[12]，首先大鼠海馬組織經(jīng)多聚甲醛-戊二醛灌流作固定處理，在海馬 CA1區(qū)取1 mm3大小組織，放入已預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中，此為前固定，因戊二醛對細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的親和力，必須經(jīng)過充分漂洗后才能進(jìn)入1%的鋨酸固定液中，因鋨酸對氮原子具有較強(qiáng)親和力，能固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成分，此為后固定[13]。固定之后，按照常規(guī)步驟操作，制作連續(xù)切片，每片厚度控制在60～90 nm 為宜，撈片，載片的銅網(wǎng)放在37℃溫箱中，干燥48 h 以上待用。

1.2.2固定載片銅網(wǎng)根據(jù)需要染色的銅網(wǎng)數(shù)量，選取適合規(guī)格的一次性醫(yī)用注射器，在注射器內(nèi)塞的頂端軟橡膠處，用干凈刀片劃出若干平行的裂隙，長約3～4 mm，裂隙間隔4～5 mm，同時(shí)在軟橡膠的邊緣做標(biāo)記，用來區(qū)分銅網(wǎng)排列方向和順序，在垂直方向用手?jǐn)D壓，使裂隙微張開，小心夾取帶有切片的銅網(wǎng)，依次插入1～2 mm 深，停止擠壓動(dòng)作，裂隙自然閉合后將銅網(wǎng)夾持住，將注射器內(nèi)塞倒轉(zhuǎn)過來，檢查一下銅網(wǎng)夾持是否牢固，確定沒有銅網(wǎng)松脫，再將內(nèi)塞小心插入針管內(nèi)（圖1）。? 1.2.3鈾染色將內(nèi)塞推至距離注射器頂端1 cm 左右的位置，用另外一個(gè)新的一次性注射器取適量鈾染液，加入染色針管里，針管垂直向上輕推至染液上方?jīng)]有空氣為止，蓋上針頭帽，用黑色遮光紙避光處理，染色時(shí)針管水平或垂直放置都可以，室溫染色20 min。染色結(jié)束，推動(dòng)內(nèi)塞將染液排出（圖2～3）。

1.2.4清洗載片銅網(wǎng)先將注射器內(nèi)塞拉出至外1/3處，用另一個(gè)新的一次性注射器取超純水，加至染色針管一半的位置，上下顛倒針管清洗銅網(wǎng)，清洗完畢，推動(dòng)內(nèi)塞將廢液排出，如此重復(fù)5次完成清洗。

1.2.5鉛染色，清洗銅網(wǎng)用另一新注射器取0.1%檸檬酸鉛染液加入針管里，同樣向上輕推內(nèi)塞桿，至染液上方?jīng)]有空氣為止，將裝好鉛染液的針管用黑色避光紙避光處理，然后豎直放進(jìn)裝有氫氧化鈉顆粒的棕色瓶中，將棕色瓶蓋蓋好，避免接觸空氣，室溫染色10 min（圖4），進(jìn)行超純水清洗銅網(wǎng)，步驟同上。清洗完畢將針管內(nèi)塞完全拔出，依次取下銅網(wǎng)，用干燥的濾紙條逐一吸去多余水分，小心將銅網(wǎng)水平放置在鋪好濾紙的平皿內(nèi)，37℃干燥48 h 后待鏡檢。

2結(jié)果

通過鏡下觀察比較，采用一次性醫(yī)用注射器批量染色法和以往的傳統(tǒng)蠟板滴染法均獲得了比較理想的圖像，腦組織海馬 CA1區(qū)神經(jīng)突觸的超微結(jié)構(gòu)清晰可見（圖5～6）。通過染色操作過程、時(shí)間和染液量比較，一次性醫(yī)用注射器批量染色法均優(yōu)于傳統(tǒng)蠟板滴染法。

3討論

3.1批量染色法與傳統(tǒng)蠟板滴染法比較

多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在透射電子顯微鏡超薄切片染色方法上采用的是傳統(tǒng)蠟板滴染法，染色過程是預(yù)先將準(zhǔn)備好的蠟板放在干凈的平皿里，用吸管取適量鈾染液在蠟板上滴一滴，然后用電鏡專用消磁鑷子夾取貼有超薄切片的銅網(wǎng)，進(jìn)染液前要仔細(xì)分辨一下正反面，正面朝上45°角插入鈾染液里，染色結(jié)束后再夾取銅網(wǎng)在超純水里點(diǎn)洗數(shù)下，用干燥濾紙條小心吸干銅網(wǎng)周圍水分，再經(jīng)過同樣的步驟進(jìn)入鉛染液染色，點(diǎn)洗、吸干水分，最后水平放在鋪好濾紙的平皿里，37℃48 h 以上干燥待鏡檢，此法不足的是：染色操作時(shí)間長，所需的染液多，由于染液滴有一定張力，在插入染液時(shí)偶爾會(huì)出現(xiàn)銅網(wǎng)插入不利的現(xiàn)象，就需要重新插入，染色過程中反復(fù)用鑷子夾持銅網(wǎng)的邊緣，增加了勞動(dòng)量，還極易破壞銅網(wǎng)和銅網(wǎng)邊緣的超薄貼片，夾持銅網(wǎng)的深度每次都要試探，夾持過深會(huì)破壞貼片的完整性。夾持時(shí)間長容易導(dǎo)致動(dòng)作僵硬，經(jīng)常出現(xiàn)銅網(wǎng)松脫甚至丟失的現(xiàn)象。每次染色的銅網(wǎng)數(shù)量要盡量限制在8片以內(nèi)，否則過多會(huì)使頭尾兩張銅網(wǎng)染色時(shí)間差距加大，同一批次的染色時(shí)間前后不一致，分析污染原因時(shí)，常不能從時(shí)間長短上調(diào)整染色的條件，進(jìn)而無法考量最優(yōu)染色條件，同時(shí)還易造成順序混亂。染液暴露在空氣中的時(shí)間相對較長，一旦造成污染，將會(huì)因重新切片給工作增加負(fù)擔(dān)，而對于極其稀少的結(jié)構(gòu)，重切可能無法再重現(xiàn)該結(jié)構(gòu)，更是重大損失。而采用一次性醫(yī)用注射器進(jìn)行批量染色克服了不足并優(yōu)于傳統(tǒng)蠟板滴染法。

3.2批量染色法的注意事項(xiàng)

采用一次性醫(yī)用注射器批量染色法，透射電鏡超薄切片貼片時(shí)，超薄切片盡量集中在銅網(wǎng)一側(cè)，另一側(cè)用來夾持，夾好銅網(wǎng)后小心調(diào)整插入的深度，使貼片部分完整暴露，夾好銅網(wǎng)的內(nèi)塞在進(jìn)入針管的瞬間，動(dòng)作一定要慢，不要觸碰銅網(wǎng)造成折損。銅網(wǎng)間隔不能太近，否則易形成氣泡，造成染色不完全或者不均勻。由于銅網(wǎng)較干燥和染液的張力作用，染色液剛接觸銅網(wǎng)時(shí)偶爾會(huì)出現(xiàn)氣泡，則應(yīng)輕輕彈撥或下拉內(nèi)塞桿并倒轉(zhuǎn)針管使染液離開銅網(wǎng)，再將針管豎直向上，讓染液重新接觸銅網(wǎng)，反復(fù)幾次操作使氣泡消除;加入鈾染液后，及時(shí)安裝上注射器針頭帽，因鈾染液具有揮發(fā)性和易分解性，長時(shí)間暴露空氣中易形成灰塵樣結(jié)晶污染，即鈾污染。加入鉛染液后不需安裝注射器帽，只需要把棕色瓶蓋及時(shí)蓋好，因?yàn)樽厣坷镆杨A(yù)先放置好氫氧化鈉顆粒，用來中和瓶子里的二氧化碳，減少了碳酸鉛的生成，避免了鉛染液[14]，必要時(shí)更換新的一次性注射器外筒。染色和清洗銅網(wǎng)的過程中動(dòng)作要輕柔，染色結(jié)束用濾紙條徹底吸干銅網(wǎng)周圍多余水分。另外，透射電子顯微鏡的制樣、超薄切片制作和染色工作，對環(huán)境的要求也很重要，室溫25℃為宜，室內(nèi)整潔無塵，避免人員走動(dòng)，無空氣流通[15]、盡量在平整的專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行;鈾染液要提前取出，室溫靜置20 min 或者離心后取上1/3澄清染液使用。鉛染液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，能有效杜絕碳酸鉛污染。實(shí)驗(yàn)人員戴口罩和無塵手套操作，使用過的注射器不能隨意丟棄，應(yīng)放在指定的實(shí)驗(yàn)垃圾回收處，實(shí)驗(yàn)廢液要嚴(yán)格集中回收處理。

3.3批量染色法的優(yōu)點(diǎn)

一次性醫(yī)用注射器是醫(yī)療用品，其內(nèi)塞構(gòu)造適宜作為批量染色工具，省去了制備和清理染色裝置的繁瑣。根據(jù)染色銅網(wǎng)的數(shù)量決定注射器的規(guī)格，節(jié)約時(shí)間、節(jié)省染液。黑色避光紙能反復(fù)使用，節(jié)約材料。銅網(wǎng)是夾插在注射器內(nèi)塞頂部的，在染色過程中不會(huì)出現(xiàn)刮擦側(cè)壁的情況，對銅網(wǎng)有一定程度的保護(hù)。鈾染液在針管里相對密閉，套上針頭塑料帽，與空氣不接觸，減少污染機(jī)會(huì)。鉛染液不需安裝注射器帽，放在預(yù)先準(zhǔn)備好的氫氧化鈉顆粒瓶中，整個(gè)染色和清洗過程不用鑷子反復(fù)夾持，銅網(wǎng)保持完好，銅網(wǎng)邊緣貼片無脫落和損壞。夾插銅網(wǎng)不必區(qū)分正反面，第一片和最后一片銅網(wǎng)的染色時(shí)間一致，不存在時(shí)間差，特別在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)有利于準(zhǔn)確調(diào)整染色時(shí)間，批量染色工具的應(yīng)用極大節(jié)省操作者的工作量。

綜上所述，一次性醫(yī)用注射器批量染色法值得推廣及應(yīng)用。

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（收稿日期：2021-10-26）