岳宏忠，張東琴，侯 棟，李亞莉，姚 拓，黃書超

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) a 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， b 園藝學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

化肥是我國目前使用量最大的農(nóng)業(yè)化學(xué)用品，其對增加土壤肥力和提高作物產(chǎn)量起著相當(dāng)重要的作用，但同時也帶來一系列問題，如農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)被破壞、環(huán)境污染嚴重、作物果實品質(zhì)下降以及食品安全性降低等[1-2]。同時，由于化肥濫用現(xiàn)象十分普遍，由此引發(fā)的土壤質(zhì)量下降問題也引起了越來越多的關(guān)注[3]。隨著最近幾年國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥和化肥“雙減”項目的推動，緩解黃瓜連作障礙和替代或部分替代化肥的綠色栽培方案也越來越多，其中微生物菌肥作為一種綠色環(huán)保的新型肥料，其部分替代化肥的試驗已在諸多作物上開展，結(jié)果顯示效果顯著[4-6]。

土壤是一個復(fù)雜而又完整的微生態(tài)系統(tǒng)，其中物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化、動植物殘體分解等生化過程主要由細菌和真菌完成，可見土壤微生物對植株的生長發(fā)育至關(guān)重要[7-10]。一般而言，穩(wěn)定性較好的土壤，微生物抵抗環(huán)境惡化的能力較強，微生物多樣性和豐富度也較高。細菌作為土壤中數(shù)量最多、分布最廣的微生物，其數(shù)量占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，干質(zhì)量約占土壤有機質(zhì)的1%[11]。傳統(tǒng)的微生物研究依賴于實驗室培養(yǎng)，而16S rRNA基因高通量測序技術(shù)的興起，填補了對在傳統(tǒng)實驗室中無法培養(yǎng)的微生物的研究空白，擴展了對微生物資源的利用空間，為研究微生物相互作用提供了有效工具[11-12]。

黃瓜是最常見的瓜類蔬菜之一，隨著日光溫室的發(fā)展，全國大部分地區(qū)均有種植。在我國北方地區(qū)，黃瓜種植多集中在日光溫室和塑料大棚中，由于栽培技術(shù)、種植習(xí)慣等原因，連作問題十分常見，尤其在種植10年以上的設(shè)施菜田中，土壤養(yǎng)分失衡、病原菌增多、有益菌減少以及土壤板結(jié)等問題普遍存在，致使黃瓜嚴重減產(chǎn)，甚至有絕收的可能，這嚴重制約了黃瓜種植業(yè)的發(fā)展[13-15]。目前關(guān)于微生物菌肥替代化肥后對黃瓜產(chǎn)量和根際土壤細菌多樣性影響的研究甚少，且微生物菌肥如何影響土壤質(zhì)量以及其作用機理尚不清楚。故本試驗以日光溫室黃瓜種植地不同施肥處理土壤為研究對象，采用高通量測序技術(shù)分析各處理土壤細菌類群的組成特征，明確化肥、微生物肥料及土壤細菌類群間的互作關(guān)系，旨在為進一步探明微生物肥料的作用機理及生產(chǎn)中化肥減量、提質(zhì)增效提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年在甘肅省慶陽市華池縣悅樂鎮(zhèn)鴨洼村(N 35°39′，E 107°51′，海拔1 297 m)進行。該區(qū)屬典型的黃土高原西部雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū),年均降雨量573 mm，主要集中在7-9月份。試驗所用日光溫室長40 m、寬7.5 m，已種植蔬菜10 年以上，其中黃瓜已連續(xù)種植3年。本試驗供試黃瓜采用嫁接栽培，砧木為黑籽南瓜，2018年10月5日播種育苗，15 d后嫁接， 11月8日定植于日光溫室，第2年7月25日拉秧，全生育期290 d。溫室內(nèi)平均氣溫19 ℃，極端最低氣溫4 ℃，最高氣溫40 ℃。溫室內(nèi)耕作層土壤全鹽含量1.55 g/kg，pH值8.23，土壤體積質(zhì)量2.62 g/m3，有機質(zhì)含量8.72 g/kg，全氮含量0.68 g/kg，全磷含量1.02 g/kg，全鉀含量23.59 g/kg，堿解氮含量63.49 mg/kg，有效磷含量20.03 mg/kg，速效鉀含量182 mg/kg，肥力水平中等。

1.2 試驗材料

試驗中微生物肥料為依托國家重點研發(fā)計劃“露地蔬菜化肥農(nóng)藥減施技術(shù)集成研究與示范”項目研發(fā)、生產(chǎn)的成熟產(chǎn)品(含4種PGPR菌株，有效活菌數(shù)≥108CFU/g)，以木炭粉和玉米芯按一定比例混合作為介質(zhì)，已在燕麥、玉米、萵筍上進行了應(yīng)用，生產(chǎn)單位為甘肅鴻遠生物科技有限公司，技術(shù)支持單位為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院與甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。執(zhí)行標準：NY/T 798-2015(農(nóng)業(yè)部登記證號：微生物肥(2012)準字0887號)[4]。

供試黃瓜品種為“甘豐袖玉”，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所培育。

試驗所用化肥是由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水灌溉農(nóng)業(yè)研究所研制的蔬菜硫基長效復(fù)合肥，其N、P2O5、K2O含量之和≥48%，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=18∶16∶14。

1.3 試驗設(shè)計

采用壟作栽培，壟行寬度80 cm，壟溝寬度40 cm，以壟行作為處理小區(qū)，以壟溝作為小區(qū)隔離，溫室兩端各設(shè)置保護行4壟。試驗設(shè)6個處理：T1.100%化肥(2 400 kg/hm2)；T2.60 kg/hm2微生物菌肥+80%化肥；T3.60 kg/hm2微生物菌肥+60%化肥；T4.60 kg/hm2微生物菌肥+40%化肥；T5.對照(CK，不施任何肥料)；T6.單施60 kg/hm2微生物菌肥。每處理1個小區(qū)，小區(qū)面積0.8 m×7 m，隨機區(qū)組排列，重復(fù)3次。各處理所用化肥在整地起壟時作為底肥撒施在相應(yīng)壟面下，所用微生物菌肥在黃瓜定植時均分施入相應(yīng)定植穴。其他田間管理措施與當(dāng)?shù)亟y(tǒng)一。

1.4 黃瓜產(chǎn)量測定與土壤樣品采集

1.4.1 黃瓜產(chǎn)量測定 在黃瓜收獲期，對每個小區(qū)分別采收黃瓜果實并稱取質(zhì)量，換算為每平方米產(chǎn)量，并計算各處理與對照(T5)相比的增產(chǎn)率。

1.4.2 土壤樣品采集與處理 待黃瓜拉秧后，在試驗小區(qū)0～20 cm土層處，采用5點取樣法取樣[16]。采樣器先用酒精消毒，待酒精揮發(fā)后再取樣，每個樣點重復(fù)取3份土樣用于土壤微生物DNA提取及后續(xù)相關(guān)指標測定。

1.5 土壤微生物總DNA提取和16S rRNA測序流程

將土樣送往上海生工生物科技公司，利用OMEGA土壤DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA。對提取到的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，查看基因組DNA的完整度與濃度，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量分析。采用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)對各處理土樣中細菌群落在門、綱、目、科、屬水平上的組成、相對豐度及優(yōu)勢菌進行分析。16S rRNA基因的通用引物為314F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)，具體測序流程參考梁志婷等[17]的方法進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

獲得原始的土壤細菌基因序列數(shù)據(jù)后，采用QIIME 1.8.0分析序列質(zhì)量和OTUs數(shù)量[14]；使用Qiime軟件(Version 1.9.1)進行各處理土壤細菌Alpha多樣性比較，其中包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)；各處理土壤基于細菌屬水平上相對豐度的主成分分析(PCA)采用Graphpad Prism 7.0軟件，基于細菌門水平上相對豐度的聚類分析采用Mothur軟件；用Excel 2007軟件對各處理黃瓜產(chǎn)量數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 16.0進行Duncan’s多重比較分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理土壤樣品測序結(jié)果

土壤細菌群落高質(zhì)量目標序列數(shù)和OTUs數(shù)見表1。由表1可知， 6種不同施肥處理共獲得高質(zhì)量目標序列474 639條。各樣品經(jīng)優(yōu)化處理后，得到的高質(zhì)量序列比例均高于80%，說明測序結(jié)果可靠，可進行下一步序列分析。

表1 不同施肥處理土壤細菌序列讀數(shù)及OTUs數(shù)

2.2 不同施肥處理土壤細菌群落的Alpha多樣性

Alpha多樣性指數(shù)能夠反映細菌群落的豐富度和均勻度。Shannon指數(shù)代表樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高；Simpson指數(shù)主要體現(xiàn)物種的優(yōu)勢度；Chao1和ACE指數(shù)主要反映細菌群落豐富度，其值越高表明群落物種的豐富度越高。如表2所示，由Shannon指數(shù)可知，不同施肥處理土壤細菌群落多樣性表現(xiàn)為T1>T2>T4>T5>T6>T3；由ACE指數(shù)可知，群落豐富度為T4>T5>T6>T1>T3>T2。6個處理中， 僅T4處理土壤細菌群落的Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù)均高于對照(T5)，分別較對照提高了2.83%，0.52%，3.63%和1.40%，說明微生物菌肥與適宜用量化肥配施能夠明顯提高土壤細菌群落的豐富度和多樣性。

表2 不同施肥處理土壤細菌群落Alpha多樣性比較

2.3 不同施肥處理土壤細菌的組成

圖1～5是不同處理土壤細菌群落相對豐度在門、綱、目、科、屬水平上的比較。由圖1～5可以看出，在門水平上，優(yōu)勢細菌是變形菌門(Proteobacteria，平均相對豐度為25.69%)、放線菌門(Actinobacteria，22.29%)和厚壁菌門(Firmicutes，21.45%)；在綱水平上，占優(yōu)勢的細菌是芽孢桿菌綱(Bacilli，21.33%)、Unidentified_Actinobacteria(11.42%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，11.13%)、嗜熱菌綱(Thermoleophilia，7.05%)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria，5.66%)等；在目水平上，占優(yōu)勢的細菌是乳桿菌目(Lactobacillales，20.09%)、土壤紅桿菌目(Solirubrobacterales，4.64%)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales，4.91%)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales，3.30%)、根瘤菌目(Rhizobiales，3.37%)；在科水平上，優(yōu)勢細菌是鏈球菌科(Streptococcaceae，19.23%)、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae，3.21%)、亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae，3.06%)、鞘酯菌科(Sphingomonadaceae，2.78%)；優(yōu)勢細菌屬是乳球菌屬(Lactococcus，18.65%)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas，2.31%)、鞘氨醇單胞菌(Pseudarthrobacter，1.41%)。隨著微生物菌肥施用比例的增加，厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、乳球菌屬相對豐度均呈先升高后降低的趨勢，其中T3處理以上優(yōu)勢菌相對豐度占比較高。

圖1 不同施肥處理土壤細菌門水平上相對豐度的比較

圖2 不同施肥處理土壤細菌綱水平上相對豐度的比較

圖3 不同施肥處理土壤細菌目水平上相對豐度的比較

圖4 不同施肥處理土壤細菌科水平上相對豐度的比較

圖5 不同施肥處理土壤細菌屬水平上相對豐度的比較

2.4 不同施肥處理土壤細菌屬水平相對豐度的主成分分析

主成分分析結(jié)果(圖6)顯示，不同施肥處理屬水平上土壤細菌物種相對豐度共提取到5個主成分，其中第1主成分(PC1) 和第2主成分(PC2)的貢獻率分別為20.18%和18.00%，二者累積貢獻率為38.18%。

由圖6還可知，施用化肥和微生物菌肥的各處理與不施任何肥料的處理，土壤細菌主要組成有比較明顯的差別，其中T1、T2、T4及T3處理土壤細菌種類分布在第二和第四象限； T6和對照T5處理分布在第一象限。可知微生物菌肥與化肥配施能夠顯著改變土壤細菌群落屬水平的組成，但不同用量化肥與微生物菌肥配施效果差異較大。

2.5 不同施肥處理土壤細菌組成門水平的聚類分析

如圖7 所示，在門水平上，不同施肥處理土壤細菌的組成可聚為3大類，其中T1和T5處理聚為一類，T2和T3處理聚為一類，T4和T6處理聚為一類。三大類相比，T4和T6處理土壤各細菌門水平相對豐度與其他兩類差別較大。同時，不同施肥處理土壤細菌門水平相對豐度不同，但是基本組成種類保持穩(wěn)定，都是以厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、奇古菌門(Thaumarchaeota)等為主。

圖7 不同施肥處理土壤細菌組成門水平聚類分析

2.6 不同施肥處理對黃瓜產(chǎn)量的影響

表3顯示，各處理產(chǎn)量由大到小依次為T2>T3>T4>T1>T6>T5，T2、T3、T4、T1、T6較對照T5分別增產(chǎn)15.33%，14.25%，9.90%，8.67%和8.01%，其中T2、T3增產(chǎn)達顯著水平；在施用相同微生物菌肥水平下，隨著化肥施用量的減少，黃瓜產(chǎn)量逐漸降低，但各處理間差異不顯著；說明施用微生物菌肥(60 kg/hm2)可以替代20%～40%的化肥，且能夠達到一定的增產(chǎn)效果。

表3 不同施肥處理對黃瓜產(chǎn)量的影響

3 討 論

土壤生物多樣性是土壤健康和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要影響因素。 微生物多樣性是反映微生物與土壤環(huán)境間相互關(guān)系的指標，不同施肥方式均能改變土壤微環(huán)境[18]。研究表明，施用微生物菌肥可顯著提高土壤微生物群落多樣性，促進有益菌的增殖[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌肥與適宜用量化肥配施能影響土壤細菌群落的豐富度和多樣性，其中T4處理土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)總體較高。豐富的微生物多樣性和豐富度會維持穩(wěn)定的土壤微生態(tài)環(huán)境，是土壤健康的標志之一[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在細菌多樣性較高的土壤中病原菌難以生長繁殖，并且微生物還能夠分泌生長活性物質(zhì)、釋放土壤酶、催化氧化還原反應(yīng)、促進有機質(zhì)礦化和污染物降解等[22-23]。微生物菌肥與化肥配施，會改善土壤環(huán)境，這可能是由于PGPR微生物菌肥對病原菌具有重寄生作用，并且會在代謝過程中產(chǎn)生具有抑菌活性的抗生物質(zhì)[24-27]，從而抑制土壤中病原菌的生長繁殖，促進有益菌占據(jù)更多的生態(tài)位點。如本研究中,PGPR微生物菌肥與60%化肥配施(T3)處理后，與植物共生的有益菌芽孢桿菌綱的相對豐度較對照顯著增加，促進了土壤健康發(fā)展，最終有利于作物生長。

本試驗中，在門水平上，PGPR微生物菌肥與不同用量化肥配施對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響并不相同，雖然各處理間有相似的優(yōu)勢菌群，例如變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，但各處理間厚壁菌門相對豐度差異較大。李海云等[28]發(fā)現(xiàn)，東祁連山不同退化程度高寒草地土壤中細菌優(yōu)勢菌群為酸桿菌門、變形菌門、厚壁菌門及放線菌門，與本研究優(yōu)勢菌群十分接近，表明變形菌門、放線菌門、厚壁菌門可能是不同生態(tài)系統(tǒng)常見的土壤細菌優(yōu)勢門類[29]。本研究中，微生物菌肥與化肥配施處理細菌群落結(jié)構(gòu)雖存在差異，但優(yōu)勢菌群組成基本相同，說明微生物菌肥和化肥配施未達到引起微生物群落結(jié)構(gòu)顯著變化的閾值，這與游偲等[30]施用枯草芽孢桿菌菌肥對煙草根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響結(jié)果類似。

本研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌肥與60%化肥配施后，土壤中有益菌(厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、乳球菌屬)的相對豐度均有所提高，菌群結(jié)構(gòu)得以改善，這為解決連作障礙問題提供了參考。在設(shè)施生產(chǎn)過程中，栽培管理不當(dāng)、農(nóng)藥和化肥的不合理施用等易造成連作障礙，尤其化肥的盲目施用，抑制了有益微生物的繁殖[31]，使連作障礙幾乎無法避免[32]。近年來運用PGPR解決連作障礙問題已經(jīng)成為研究熱點并且成效顯著[25-27,31]。有研究表明，施用微生物菌肥不僅會促進黃瓜營養(yǎng)生長，而且還可提高產(chǎn)量和果實中維生素C、可溶性糖含量等[33]。王歸鵬等[5]研究發(fā)現(xiàn)，施用微生物菌肥不僅可以提高基質(zhì)中的養(yǎng)分含量和基質(zhì)酶活性，還可顯著提高番茄產(chǎn)量。此外，PGPR微生物菌肥對辣椒、番茄的生長和產(chǎn)量也有明顯的促進作用[34]。本研究結(jié)果表明，80%～60%化肥與PGPR微生物菌肥配施后，黃瓜產(chǎn)量較對照(T5)顯著增加，且效果優(yōu)于單施化肥(T1)或單施微生物菌肥(T6)的處理。究其原因，一方面是由于微生物菌肥代謝產(chǎn)生的一系列酶或有機酸可對土壤中難溶性的磷、鉀肥進行分解，從而將其轉(zhuǎn)化為植物所能吸收的磷、鉀肥；另一方面，盡管化肥肥效快、養(yǎng)分含量高，但是化肥利用率低，易揮發(fā)和流失，并造成土壤板結(jié)；而微生物菌肥與化肥配施后，延長了土壤中有效養(yǎng)分的供給，保證了養(yǎng)分釋放周期與作物生育周期的協(xié)調(diào)性，有利于黃瓜根系對養(yǎng)分的吸收，從而促進干物質(zhì)的積累。

綜上可知，在減施20%～40%化肥時施用適量微生物菌肥，不僅能夠提高土壤細菌多樣性，還能增加土壤有益菌的相對豐度，同時也能達到一定的增產(chǎn)效果。