李馨 張瑜 倪婷婷 魯亮

貴州省人民醫(yī)院腫瘤科（貴陽(yáng)550002）

卵巢癌是指起源于卵巢的惡性腫瘤，調(diào)查顯示［1］我國(guó)近10年來(lái)卵巢癌的發(fā)病率已增長(zhǎng)30%，且仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。另有研究［2-3］顯示，約有70%的卵巢癌患者確診時(shí)已處于晚期，5年生存率低于30%。靶向治療［4-5］是指在細(xì)胞分子水平上針對(duì)明確的致癌位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，使其能夠特異性與致癌位點(diǎn)結(jié)合促使腫瘤細(xì)胞凋亡，是一種新型、高效、安全的治療技術(shù)，也是目前抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。但是目前人們對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制仍缺乏深入的認(rèn)識(shí)，對(duì)靶向治療的研究也僅僅處于起步階段。

泛素結(jié)合酶E2T（UBE2T）是泛素結(jié)合酶E2 家族中的重要成員，已有大量研究證實(shí)該分子與細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6-7］。UBE2T 可促使抑癌基因泛素化，降解抑癌基因表達(dá)的蛋白，促使惡性腫瘤細(xì)胞增殖；UBE2T 還可激活其下游的蛋白激酶B（AKT）、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1），增強(qiáng)二者的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞G1 期到S期的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性［8-9］。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)［10］采用藥物降低癌細(xì)胞UBE2T 的表達(dá)有助于抑制細(xì)胞增殖。另有研究［11］表明UBE2T 可調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲。據(jù)此推測(cè)UBE2T基因異常表達(dá)可能參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而目前關(guān)于UBE2T 基因干擾是否可通過(guò)抑制AKT 和Cyclin D1 的表達(dá)及其生物學(xué)作用從而影響人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 的增殖尚未可知。故此本研究進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，旨在為卵巢癌靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3（北京生命科學(xué)研究所，批號(hào)：CC19011136）；慢病毒包裝質(zhì)粒（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：1904152A）。

1.1.2 主要試劑 AgeI 酶、EcoRI 酶（美國(guó)NEB 公司，批號(hào)：1812117、1810145）；puromycin 溶液（上海信帆生物科技有限公司，批號(hào)：1811075012）；Trizol試劑盒、蛋白抽提試劑盒（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：1901145001、1902183007）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1902138C）；鼠抗人UBE2T、AKT、Cyclin D1、p-AKT單克隆抗體、兔抗鼠UBE2T、AKT、Cyclin D1、p-AKT 多克隆抗體（酶標(biāo)記）（Abcam 中國(guó)公司，批號(hào)：2018172、2019103、2019015、2019041、2019112、2019045、2019158、2019116）；UBE2T-shRNA 序列、UBE2T、AKT、Cyclin D1 引物序列均委托寶生物（大連）科技有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 EasyCycler 96 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（德國(guó)耶拿公司）；CX23 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；LWD300-38CLFT 型倒置顯微鏡（西安測(cè)維光電技術(shù)有限公司）；CFM-100A 型熒光顯微鏡（上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司）；CytoFLEX S 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、分組及干預(yù) 取人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 將其復(fù)蘇后置入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后離心棄去上清液，再次加入適量培養(yǎng)液并將細(xì)胞吹打均勻，移液至培養(yǎng)皿中，擰松瓶口，至于37 ℃、5%濃度二氧化碳、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 ～3 d，觀察細(xì)胞傳代情況。參照shRNA 的基本設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)shRNA 序列［12］。構(gòu)建UBE2T-shRNA、攜帶UBE2T、NC-shRNA 基因的慢病毒載體，將其轉(zhuǎn)染至人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，分別記為沉默組、轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組；并取未轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，記為空白對(duì)照組。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度均調(diào)整為1×105個(gè)/mL。熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，且均用含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。

1.2.2 UBE2T 基因干擾效率鑒定 （1）采用RTqPCR 檢 測(cè)UBE2T mRNA 表達(dá)，UBE2T 引物上游：5'-TGATCGATATGCGGCGAATTAGCTAG-3'，下游：5'-CGATTAGCGGCGAGAGAGTAGCTAGC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：278 bp；內(nèi)參β-actin 引物上游：5'-TAGCTTGGCTAGAGCTGAGC-3'，下游：5'-AGGCTAGAGCTATAGCTATG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：202 bp。采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，提純定量，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配置反應(yīng)體系，包括去離子水10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，預(yù)混液（GoTaq?qPCR Master Mix）7.2 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)流程：94 ℃（2 min），40個(gè)循環(huán)：94 ℃（15 s），60 ℃（1 min），最后95 ℃（1 min）、冷卻至55 ℃。計(jì)算2-△△Ct。（2）采用Western blot 檢測(cè)UBE2T 蛋白表達(dá)：加入裂解液，提取細(xì)胞總蛋白。取40 μg 總蛋白及蛋白標(biāo)志物3 μL上樣，將電泳槽置于冰上電泳。根據(jù)預(yù)染的標(biāo)志物分子量在分離膠上確定目的蛋白的位置，將多余的凝膠去除，100 V 轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜，并將一抗按照相應(yīng)倍數(shù)稀釋?zhuān)瑢⑥D(zhuǎn)膜后的樣品置于一抗工作液，4 ℃過(guò)夜；洗膜后置入二抗工作液中搖床孵育2 h，室溫。洗膜、化學(xué)發(fā)光，顯影、定影和分析。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及增殖抑制率檢測(cè) （1）各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；（2）MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。向每孔中加入MTT 試劑（5 g/L）共10 μL，連續(xù)培養(yǎng)4 h后向其中加入十二烷基硫酸鈉100 μL，采用多功能微孔板測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)570 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，計(jì)算增殖抑制率=（OD對(duì)照-OD觀察）/OD對(duì)照×100.00%。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，取70%冰乙醇（4 ℃）固定，以滅菌的磷酸鹽緩沖液清洗、離心，撇去上清液后加入RNAase 150 μL 和碘化丙啶（PI）染液150 μL，室溫下避光染色30 min。離心，撇去上清液，以磷酸鹽緩沖液重懸后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 AKT、Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)及p-AKT水平檢測(cè) AKT、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)檢測(cè)參照1.2.3 中RT-qPCR 步驟，其中AKT 引物上游：5'-TAGCATAGCGGCGGATAGCA-3'，下游：5'-CTAGAGCGGCGCGATACTAG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：246 bp，Cyclin D1 引物上游：5'-ATAGCGGCGGATAGCGGCGAGAGATC-3'，下游：5'-AAAGAGGCGGAGAGCTGCGAGAGGAG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：310 bp。AKT、Cyclin D1 蛋白表達(dá)及p-AKT 水平檢測(cè)參照1.2.3 中Western blot 步驟。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，比較采用方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 puromycin 最優(yōu)濃度篩選結(jié)果 將puromycin 2.0 μg/mL 作為人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞加壓篩選的最優(yōu)濃度，見(jiàn)表1。

表1 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 細(xì)胞對(duì)puromycin 的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of drug sensitivity test of human ovarian cancer cell line SKOV3 to puromycin ±s

表1 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 細(xì)胞對(duì)puromycin 的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of drug sensitivity test of human ovarian cancer cell line SKOV3 to puromycin ±s

puromycin濃度0 μg/mL 0.5 μg/mL 1.0 μg/mL 1.5 μg/mL 2.0 μg/mL 2.5 μg/mL例數(shù)3 3 3 3 3 3 48 h細(xì)胞凋亡率（%）0 14.25±2.18 22.74±4.06 31.82±5.97 58.76±6.13 71.22±7.34 72 h細(xì)胞凋亡率（%）0 23.57±4.15 30.35±5.19 51.28±6.90 100 100

2.2 轉(zhuǎn)染率結(jié)果 陰性對(duì)照組、沉默組、轉(zhuǎn)染組熒光視野均見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率分別為（91.06 ±8.71）%、（94.61 ± 10.55）%、（93.25 ± 11.36）%，見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞熒光圖（×200）Fig.1 Cell fluorescence diagram of each group（×200）

2.3 UBE2T 基因干擾效率鑒定結(jié)果 轉(zhuǎn)染組UBE2T mRNA 及蛋白表達(dá)均高于其余3 組（P＜0.05），沉默組UBE2T mRNA 及蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組UBE2T mRNA 及蛋白表達(dá)對(duì)比Tab.2 Comparison of UBE2T mRNA and protein expressions in each group ±s

表2 各組UBE2T mRNA 及蛋白表達(dá)對(duì)比Tab.2 Comparison of UBE2T mRNA and protein expressions in each group ±s

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP ＜0.05；與沉默組比較，cP ＜0.05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組沉默組轉(zhuǎn)染組F 值P 值例數(shù)3 3 3 3 UBE2T mRNA 表達(dá)1.43±0.21 1.40±0.20 0.55±0.07ab 1.69±0.31abc 32.506＜0.001 UBE2T 蛋白表達(dá)1.02±0.15 0.98±0.16 0.27±0.05ab 1.73±0.33abc 21.228＜0.001

2.4 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組均可見(jiàn)細(xì)胞連接緊密，聚集片狀生長(zhǎng)，透光性良好；沉默組可見(jiàn)細(xì)胞呈圓形或類(lèi)圓形，排列紊亂，形態(tài)多變，相對(duì)分散，細(xì)胞內(nèi)顆粒感增強(qiáng)，透光性差，細(xì)胞間界限模糊且存活細(xì)胞少，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（倒置相差顯微鏡，×200）Fig.2 Morphological changes of cells in each group（inverted phase contrast microscope，×200）

2.5 各組細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、沉默組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率分別為0、（0±0.01）%、（38.71±9.15）%、（-32.56±6.13）%，沉默組均高于其余3 組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。

2.6 各組細(xì)胞周期觀察對(duì)比 沉默組G1 期高于其余3 組（P＜0.05），S 期和G2 期均低于其余3 組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組G1 期低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），S 期和G2 期均高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表3。

圖3 各組細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fig.3 Cell cycle detection by flow cytometry in each group

表3 各組細(xì)胞周期對(duì)比Tab.3 Comparison of cell cycle in each group±s

表3 各組細(xì)胞周期對(duì)比Tab.3 Comparison of cell cycle in each group±s

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP ＜0.05；與沉默組比較，cP ＜0.05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組沉默組轉(zhuǎn)染組F 值P 值例數(shù)3 3 3 3 G1 37.63±6.82 39.85±5.71 69.65±7.88ab 28.45±4.68abc 49.173＜0.001 S 49.63±8.51 51.88±9.02 24.69±4.51ab 54.68±10.12abc 41.205＜0.001 G2 13.50±2.41 12.75±2.57 6.05±1.08ab 16.87±3.05abc 8.195 0.001

2.7 各組細(xì)胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)和AKT、Cyclin D1 蛋白表達(dá)及p-AKT 對(duì)比 沉默組細(xì)胞AKT、Cyclin D1 mRNA 及蛋白表達(dá)，p-AKT水平均低于其余3 組（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組AKT、Cyclin D1 mRNA 及蛋白表達(dá)，p-AKT 水平均高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)、AKT、Cyclin D1 蛋白表達(dá)及p-AKT 對(duì)比Tab.4 Comparison of Akt and cyclin D1 mRNA expressions，Akt，cyclin D1 proteins and p-Akt levels in cells of each group±s

表4 各組細(xì)胞AKT、Cyclin D1 mRNA 表達(dá)、AKT、Cyclin D1 蛋白表達(dá)及p-AKT 對(duì)比Tab.4 Comparison of Akt and cyclin D1 mRNA expressions，Akt，cyclin D1 proteins and p-Akt levels in cells of each group±s

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與陰性對(duì)照組比較，bP ＜0.05；與沉默組比較，cP ＜0.05

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組沉默組轉(zhuǎn)染組F 值P 值例數(shù)3 3 3 3 AKT 1.22±0.24 1.24±0.25 0.83±0.12ab 1.36±0.28abc 27.168＜0.001 Cyclin D1 1.17±0.23 1.14±0.26 0.56±0.09ab 1.42±0.26abc 22.305＜0.001 AKT 蛋白1.28±0.24 1.31±0.26 0.69±0.11ab 1.65±0.3abc 49.865＜0.001 Cyclin D1 蛋白0.72±0.11 0.76±0.13 0.38±0.05ab 1.03±0.22abc 28.763＜0.001 p-AKT 0.32±0.05 0.30±0.04 0.17±0.03ab 1.18±0.24abc 7.502 0.002

3 討論

本研究通過(guò)構(gòu)建UBE2T-shRNA 載體并以慢病毒包裝可整合進(jìn)入基因組并保持長(zhǎng)效轉(zhuǎn)染，還轉(zhuǎn)染攜帶UBE2T 基因的質(zhì)粒介導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 基因轉(zhuǎn)染從而實(shí)現(xiàn)UBE2T 的基因干擾。此外，本研究經(jīng)不同濃度的puromycin 作用于人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞加壓篩選的最優(yōu)濃度為2.0 μg/mL，為后期獲得高轉(zhuǎn)染率奠定了基礎(chǔ)。本研究陰性對(duì)照組、沉默組和轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染率均較高，提示獲得了穩(wěn)定表達(dá)株；沉默組UBE2T mRNA 與蛋白表達(dá)均顯著低于其余3 組，且轉(zhuǎn)染組UBE2T mRNA 與蛋白表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，表明前期工作已順利完成。

本研究發(fā)現(xiàn)UBE2T 基因沉默可促使人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，抑制其增殖，且主要是通過(guò)阻滯細(xì)胞從G1 期向S 期分化實(shí)現(xiàn)此作用的；而UBE2T 基因轉(zhuǎn)染則可起反作用。UBE2T 屬于泛素蛋白酶降解系統(tǒng)，可參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡等［13］。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道顯示［14］，UBE2T 基因轉(zhuǎn)上調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中UBE2T 蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)其水平升高，同時(shí)細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，本研究結(jié)果與其具有一致性；此外，有研究［15］利用si-UBE2T 載體沉默鼻咽癌細(xì)胞系5-8F 細(xì)胞中UBE2T 蛋白表達(dá)可降低OD值，同時(shí)還可減弱細(xì)胞遷移與侵襲能力，本研究報(bào)道與其相符；另有臨床研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中UBE2T 蛋白表達(dá)高于癌旁正常組織，且與臨床分期等密切相關(guān)［16］。

本研究表明UBE2T 基因沉默很可能是通過(guò)下調(diào)AKT、Cyclin D1 mRNA 與蛋白表達(dá)和p-AKT 水平實(shí)現(xiàn)抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 增殖，抑制G1 期向S 期分化的；而UBE2T 基因轉(zhuǎn)染的作用正相反。有研究表明［17］，UBE2T 是泛素傳遞網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵，可通過(guò)經(jīng)典的信號(hào)調(diào)控通路影響惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。CHEN 等［18］報(bào)道顯示，UBE2T 基因高表達(dá)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。AKT 和Cyclin D1 均位于UBE2T 的下游，二者在細(xì)胞存活、增殖與凋亡過(guò)程中均有重要的調(diào)控作用［19］。有報(bào)道［20］發(fā)現(xiàn)，UBE2T可正向調(diào)控AKT的表達(dá)，沉默UBE2T基因表達(dá)可下調(diào)后者的表達(dá)，同時(shí)還可降低p-AKT 水平，推測(cè)可通過(guò)此途徑抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與上述報(bào)道和分析均一致。

綜上所述，UBE2T 基因沉默可抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 增殖和G1 期向S1 期分化，推測(cè)是通過(guò)抑制UBE2T、AKT、Cyclin D1 mRNA 與蛋白表達(dá)和p-AKT 水平實(shí)現(xiàn)此作用的。但沉默UBE2T 是否能夠?qū)w內(nèi)接種SKOV3 腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用尚不清楚，且調(diào)控UBE2T 基因是如何調(diào)控其下游的AKT、Cyclin D1 表達(dá)的尚未闡明，后期仍需要進(jìn)一步探討。