張潮 楊巍 (北華大學醫(yī)學技術(shù)學院臨床免疫學教研室，吉林 吉林 132013)

2型糖尿病(T2DM)是一種慢性炎癥性疾病，其發(fā)生與巨噬細胞極化失衡(M1/M2失衡)有關(guān)〔1～3〕。miR-7977是一種與炎癥相關(guān)的微小RNA〔4，5〕，且在T2DM患者外周血中高表達，但目前尚不清楚miR-7977在T2DM發(fā)展過程中有何生物學作用。本文旨在探討miR-7977對單核巨噬細胞極化的影響及相關(guān)機制，為T2DM治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1血液標本 隨機選取北華大學附屬醫(yī)院2018年1月至2019年12月確診的T2DM患者40例〔男23例，女17例；年齡(50.23±6.35)歲〕和同年齡段健康體檢者40例(男女各20例)作為受檢對象。于清晨空腹情況下留取受檢者肘靜脈血，肝素抗凝。

1.2主要試劑 Ficoll人淋巴細胞分離液、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白濃度檢測試劑盒及實驗所需引物均由北京鼎國生物技術(shù)公司提供。Hsa-miR-7977 inhibitor和negative control由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。兔抗人多克隆神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF)2抗體購自武漢艾美捷科技公司。PE標記的兔抗人CD68抗體和APC標記的兔抗人CD206抗體購自上海凱博生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自天根生物技術(shù)有限公司。MicroChemi化學發(fā)光凝膠成像儀為以色列DNR公司產(chǎn)品，ABI prism7000熒光定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。圖像分析采用ImagJ軟件。

1.3人外周血單核細胞的提取 將采集的外周血離心洗滌后加等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋2倍，并緩慢滴加在淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心30 min，吸取白色細胞層置于新的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后去掉懸浮的淋巴細胞，即獲得單核細胞。

1.4qRT-PCR 采用Trizol法提取細胞總RNA，Nano-Drop 2000微量分光光度計進行RNA定量。按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行qPCR檢測。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)；4℃保存。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝影，Quantity One軟件進行掃描分析，采用2-ΔΔCt法計算。實驗所用引物序列如下：GAPDH：上游5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游5′-ACTCCACGACATACTCAGC-3′；miR-7977：上游5′-TTCCCAGCCAACGCACC-3′，下游5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3′；NF2：上游5′-ACCGTTGCCTCCTGACATAC-3′，下游5′-GGCCTCGATTTCTGTCTTGA-3′；白細胞介素(IL)-4：上游5′-GTCTCACCTCCCAACTGCTT-3′，下游5′-CTTGGAGGCAGCAAAGATGT-3′；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β：上游5′-CAATTCCTGGCGATACCTCAG-3′，下游5′-GCACA ACTCCGGTGACATCAA-3′；腫瘤壞死因子(TNF)-α：上游5′-GCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG-3′，下游5′-ATGATCTGAGTGTGAGGGTCTGG-3′；iNOS：上游5′-GAGCTTCTACCTCAAGCTATC-3′，下游5′-CCTGATGTTGCCATTGTTGGT-3′。

1.5細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及干預(yù) 將T2DM患者外周血單核細胞培養(yǎng)后調(diào)整濃度至1×105個/ml，接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用 Lipofectamine2000將miR-7977 inhibitor和陰性control分別轉(zhuǎn)染到單核細胞中，轉(zhuǎn)染24 h后將轉(zhuǎn)染液更換為正常細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用0.1 mg/L的脂多糖(LPS)誘導單核細胞向巨噬細胞轉(zhuǎn)化。細胞分成4組，即細胞對照組(單核細胞)、LPS刺激組(單核細胞+0.1 mg/L LPS)、miR-7977抑制組(100 ng/μl miR-7977 inhibitor+單核細胞+0.1 mg/L LPS)和陰性對照組(100 ng/μl miR-7977陰性control+單核細胞+ 0.1 mg/L LPS)。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞M1、M2表型 將不同處理組的細胞分別用冰預(yù)冷的PBS洗滌3次，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml后再分成2管，分別加入PE抗人CD68抗體和APC抗人CD206抗體，4℃避光孵育30 min，再經(jīng)PBS洗滌重懸后用流式細胞儀檢測M1、M2表型。

1.7Western印跡 取各組細胞1×106個，放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解后用BCA法測定蛋白濃度，變性離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western印跡實驗流程，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、顯影的操作步驟。以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相對表達量，檢測NF2蛋白的表達。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-7977在外周血單核細胞中的表達 miR-7977在T2DM患者外周血單核細胞中的表達(3.07±0.16)明顯高于健康對照組(0.99±0.14，P<0.01)。

2.2轉(zhuǎn)染前后單核細胞中miR-7977的表達 miR-7977 抑制組細胞中miR-7977的表達(0.89±0.10)較細胞對照組(3.07±0.16)明顯降低(P<0.01)。而陰性對照組(3.05±0.13)和細胞對照組miR-7977表達無明顯差異(P>0.05)。

2.3抑制miR-7977的表達對M1/M2表型的影響 細胞對照組M1型細胞比例和M1/M2比值明顯低于LPS刺激組(P<0.05)。miR-7977抑制組M1型細胞比例和M1/M2比值明顯低于LPS刺激組，M2型細胞比例明顯高于LPS刺激組(P<0.05)。陰性對照組的M1型和M2型細胞比例以及M1/M2比值與LPS刺激組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組M1/M2表型比例

2.4抑制miR-7977表達對相關(guān)細胞因子mRNA表達的影響 miR-7977抑制組IL-4和TGF-β的mRNA表達與LPS刺激組比較明顯升高(P<0.05)；而TNF-α和iNOS的mRNA表達較LPS刺激組明顯降低(P<0.05)。陰性對照組和LPS刺激組的四種細胞因子的mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組相關(guān)細胞因子mRNA表達

2.5干擾miR-7977對NF2表達的影響 miR-7977抑制組NF2的mRNA和蛋白相對表達量較LPS刺激組和陰性對照組均明顯升高(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組NF2蛋白表達

表3 各組NF2 mRNA及蛋白表達

3 討 論

單核-巨噬細胞系統(tǒng)是固有免疫的重要組成，不同病理生理環(huán)境下，單核細胞可向M1型或M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化〔6〕。M1 型巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、iNOS等促炎性細胞因子，啟動和維持炎癥反應(yīng)；M2 型巨噬細胞分泌TGF-β、IL-4等細胞因子，與抗炎反應(yīng)有關(guān)〔7～9〕。T2DM時，胰島細胞周圍浸潤著大量極化異常的巨噬細胞，這些巨噬細胞分泌的炎癥分子進一步加重胰島β 細胞的損傷〔10〕。本研究結(jié)果提示抑制miR-7977表達可以干擾LPS引起的單核細胞M1型極化；降低miR-7977表達可以抑制LPS引起的M1型細胞因子的表達，同時促進M2型細胞因子的表達；降低miR-7977表達可以抑制LPS誘導的單核細胞M1型極化，降低M1型細胞因子的表達。

Hippo通路是真核細胞中參與增殖分化的信號傳導通路，研究發(fā)現(xiàn)其在天然免疫和炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔11〕。Hippo信號通路關(guān)閉時，巨噬細胞向M1型極化；Hippo信號通路活化時，巨噬細胞則向M2型極化〔12〕。NF2是Hippo通路的上游調(diào)節(jié)因子，NF2功能喪失時，Hippo通路信號失活；NF2活性正?；蛏邥r則激活Hippo信號傳導〔13〕。本研究結(jié)果說明miR-7977可以直接影響NF2的表達，進而影響Hippo通路的信號傳導。這一結(jié)果與Yoshida等〔14〕的研究結(jié)果相一致。

綜上，T2DM患者外周血單核細胞中的miR-7977通過抑制NF2基因表達，干擾Hippo信號通路的傳導，進而調(diào)節(jié)單核細胞向M1型極化，加重胰島細胞外環(huán)境的炎癥狀態(tài)。而降低miR-7977表達則可以上調(diào)NF2的表達，從而抑制單核細胞向M1型巨噬細胞極化。降低單核細胞M1型極化水平已經(jīng)被證實是調(diào)節(jié)T2DM炎癥狀態(tài)的有效方式之一。本研究結(jié)果為T2DM的抗炎治療提供了新靶點。