陳燁 王昱 喻海燕 賈崇高 顏潤 (貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病的并發(fā)癥之一，由于其早期發(fā)病較為隱匿導(dǎo)致患者確診時已處于進展期，隨著疾病的發(fā)展可最終形成終末期腎病從而降低治療效果，患者5年生存率較低〔1～3〕。因而早期診斷及治療DN具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)表達異?？蓞⑴cDN等多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程，但LncRNA在DN發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制尚未完全闡明〔4〕。LncRNA H19在糖尿病性心肌病中的表達下調(diào)，上調(diào)其表達可抑制心肌細胞凋亡〔5〕。但LncRNA H19在DN患者血清中的表達及其臨床意義尚未闡明。幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1(YKL-40)是一種炎性蛋白，其可在冠心病、糖尿病動脈粥樣硬化等過程中表達上調(diào)，并可能參與多種炎癥性疾病發(fā)生及發(fā)展過程〔6〕。因此，本研究主要探討DN患者血清LncRNA H19、YKL-40的表達水平，探究LncRNA H19與YKL-40及患者生化指標的相關(guān)性，為DN的診斷及治療提供潛在的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2018年5月貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院收治的80例2型糖尿病患者為研究對象，患者均符合2型糖尿病診斷標準〔7〕，根據(jù)DN診斷標準將患者分為無DN組(22例)與DN組(58例)〔8〕。根據(jù)尿微量白蛋白、腎功能、肌酐水平將DN患者分為DN 3期25例，DN 4期19例，DN 5期14例〔9〕。無DN組中男12例、女10例，平均年齡(52.32±7.59)歲。DN組中男34例、女24例，平均年齡(51.32±8.75)歲。同時選取醫(yī)院體檢中心的健康志愿者30例為對照組，其中男16例、女14例，平均年齡(50.23±6.25)歲。各組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1采集血液樣本 研究對象均于清晨分別抽取空腹靜脈血5 ml，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，分離血清置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測LncRNA H19的表達水平 采用Trizol法提取血清中的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。LncRNA H19正向引物5′-TCCTGAACACCTTAGGCTGG-3′，反向引物5′-TTCACCTTCAGAGC CGATT-3′；GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物5′-GGAAGATG GTGATGGGATT-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。LncRNA H19以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA H19相對表達量。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測YKL-40的水平 采用ELISA檢測血清YKL-40的水平，檢測試劑盒購自美國Quidel公司，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4觀察指標 應(yīng)用cobas c311型全自動生化分析儀(美國羅氏公司)檢測血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)的水平。應(yīng)用i2000型電化學發(fā)光全自動免疫分析儀檢測血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗、Pearson分析。

2 結(jié) 果

2.13組BMI、BUN、CREA及血清LncRNA H19、YKL-40水平比較 與對照組和無DN組比較，DN組BUN、CREA水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3組BMI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.23組血清LncRNA H19、YKL-40水平比較 與對照組比較，無DN組、DN組血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)；與無DN組比較，DN組血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組BMI、BUN、CREA及血清LncRNA H19、YKL-40水平比較

2.3DN患者不同亞組血清LncRNA H19、YKL-40的水平比較 與DN 3期比較，DN 4期、DN 5期患者血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)；與DN 4期比較，DN 5期患者血清LncRNA H19表達水平顯著降低(P<0.05)，YKL-40水平顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 DN患者不同亞組血清LncRNA H19、YKL-40水平比較

2.43組生化指標水平比較 與對照組比較，無DN組、DN組TG、TC、LDL-C、Hcy水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與無DN組比較，DN組TG、TC、LDL-C、Hcy水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 3組生化指標水平比較

2.5DN患者血清LncRNA H19與YKL-40、TG、TC、LDL-C、HDL-C、Hcy的相關(guān)性分析 LncRNA H19與YKL-40、TG、TC、Hcy呈負相關(guān)(r=-0.855、-0.775、-0.377、-0.933；均P<0.05)與LDL-C、HDL-C無顯著相關(guān)性(r=0.141、-0.043，均P>0.05)。

3 討 論

LncRNA在DN患者血清中的表達及其可能作用機制等相關(guān)研究尚處于起步階段，深入探討LncRNA在DN發(fā)生及發(fā)展過程中的作用對提高DN早期診斷效率及治療效果具有重要意義，還可為闡釋DN發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)〔10〕。

LncRNA H19表達上調(diào)可抑制高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜上皮細胞炎癥反應(yīng)〔11〕。LncRNA H19還可抑制高血糖誘導(dǎo)的人靜脈內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)〔12〕。LncRNA H19可抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展進程〔13〕。LncRNA H19表達下調(diào)可促進高血糖癥的發(fā)生〔14〕。本研究結(jié)果提示LncRNA H19在DN發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)隨著血清LncRNA H19的表達水平降低DN病情愈加嚴重。提示LncRNA H19可能作為判斷DN病情嚴重程度的重要生物學指標。

DN患者血清YKL-40水平升高，并可能是動脈粥樣硬化的危險因素之一〔15〕。血清YKL-40水平升高可增加2型糖尿病視網(wǎng)膜病變、DN的發(fā)生風險，其水平升高與疾病嚴重程度呈正相關(guān)〔16〕。YKL-40水平升高與2型糖尿病大血管病變發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，并可能作為早期診斷2型糖尿病大血管病變的重要指標〔17〕。YKL-40水平升高還與腦梗死發(fā)生密切相關(guān)〔18〕。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。本研究進一步分析提示YKL-40水平升高預(yù)示DN病情嚴重。本研究相關(guān)分析結(jié)果提示LncRNA H19表達水平降低可能促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而誘導(dǎo)機體代謝異常最終促進DN的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，DN患者血清LncRNA H19表達水平降低，YKL-40水平升高，二者呈負相關(guān)且均可參與DN發(fā)生及發(fā)展過程，其可作為判斷疾病嚴重程度的重要生物學指標，可為DN治療提供新方向，并可為尋找DN診斷及評估疾病進展的生物學標志物的研究提供理論依據(jù)。但DN發(fā)生及發(fā)展的影響因素較為復(fù)雜，關(guān)于其具體的發(fā)病機制尚需深入探究。