摘要 [目的] 建立高效液相色譜法測(cè)定盤龍七中沒食子酸含量的方法，并測(cè)定14個(gè)不同產(chǎn)地盤龍七中沒食子酸的含量。[方法]高效液相色譜法，Inertsil ODS3C18（4.6×150 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（7∶93），流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm，柱溫30 ℃。[結(jié)果]沒食子酸在5.3～ 53.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，Y=31 446X-15 550 （R2=0.999 9），平均加樣回收率99.995%，RSD為1.704%。不同產(chǎn)地盤龍七中沒食子酸的含量不同，其含量隨產(chǎn)地的不同而顯示出明顯差異，其變化范圍在1.704 4～8.639 3 mg/g。[結(jié)論]該研究建立的沒食子酸含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于不同產(chǎn)地盤龍七藥材的質(zhì)量控制。文縣產(chǎn)盤龍七中沒食子酸含量較豐富，具有進(jìn)一步的開發(fā)利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;盤龍七;沒食子酸;含量

中圖分類號(hào) "S567 "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A "文章編號(hào) 0517-6611（2014）32-11276-03

Determination of Gallic Acid in Rhizoma Bergenia scopulosa from Different Areas by HPLC

WANG Xing， ZHANG Na， "MA Yingli et al "（College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000）

Abstract "[Objective] To establish a method for determination of gallic acid in rhizoma Bergenia scopulosa and detect gallic acid in rhizoma Bergenia scopulosa from 14 different areas. [Method] The HPLC separation was performed on an Inertsil ODS∶3 C18 column（4.6×150 mm， 5 m）at a flow rate of 1. 0 "ml/min， column temperature of 30 "℃， detection was monitored at 271 nm. The mobile phase was methanol- 0. 4% phosphoric acid （7∶93）. [Result] There was well linear relationship for gallic acid in range of 5.3 to 53.0 "g/ml and the regression equation for it was Y=31 446X-15 550（R2=0.999 9）， the average recovery was 99.995% with RSD of 1.704%（n=9）. The result showed an obvious difference in the contenst of gallic acid among 14 different origins， the contents of gallic acid were range between 1.704 4 to 8.639 3 mg/g. [Conclusion] The established method is simple， accurate， repeatable and can be used for the quality control of rhizoma Bergenia scopulosa.The rhizoma Bergenia scopulosa from Wenxian County has further development and utilization value for its richer gallic acid.

Key words "HPLC; Rhizoma Bergenia scopulosa; Gallic acid; Content

盤龍七為虎耳草科巖白菜屬植物秦嶺巖白菜（Bergenia scopulosa T.P.Wang）的干燥根莖，多年生草本，分布于陜西、四川及甘肅東南部[1]。盤龍七是陜西民間常用藥，味澀、微苦，性平，補(bǔ)益脾胃，收澀固腸，利水活血，主治急慢性腸胃炎、痢疾、浮腫、淋癥、白帶、崩漏、黃水瘡、禿瘡、疥癬等[1-2]。沒食子酸又名五倍子酸、棓酸，化學(xué)名 3，4，5三羥基苯甲酸（C7H6O5），為白色或淡黃色針狀結(jié)晶或粉末，通常是以一水合物的形式存在，具有抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗氧化、抗自由基、抗菌、抗肝損傷、抗病毒等作用，是一種重要的有機(jī)原料，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品 、染料、輕工等領(lǐng)域[3-4]。盤龍七中的活性成分主要為巖白菜素、熊果苷、沒食子酸、兒茶素等。迄今為止，關(guān)于盤龍七中的有效成分沒食子酸含量測(cè)定的研究尚未見報(bào)道。為更好地進(jìn)行藥材質(zhì)量控制并進(jìn)一步開發(fā)利用該藥材資源，筆者采用高效液相色譜法對(duì)不同產(chǎn)地盤龍七藥材中沒食子酸的含量進(jìn)行了分析，以期為盤龍七資源的進(jìn)一步開發(fā)利用以及藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試藥

藥材主要來源于洛南縣、鎮(zhèn)安縣、留壩縣、洋縣、勉縣、鳳縣、太白縣、眉縣、戶縣、禮縣、文縣、宕昌縣、九寨溝縣、青川縣，經(jīng)陜西理工學(xué)院植物學(xué)教授趙樺鑒定為盤龍七。

1.2 主要儀器

Waters E2695高效液相色譜儀（包括四元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、2489紫外檢測(cè)器），Empower色譜工作站;UV2550紫外分光光度計(jì)（日本島津）;AB204S電子分析天平（瑞士 Mettler Toledo公司）;KQ300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），UPHII20T優(yōu)普超純水機(jī)（成都優(yōu)普凈化科技有限公司）。

1.3 主要試劑 "沒食子酸對(duì)照品購自上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)（20140620）。甲醇（色譜純）購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;甲醇（分析純）購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司，磷酸（分析純） 購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司，水為自制超純水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜條件。

色譜柱為Inertsil "ODS3C18（4.6×150 mm，5 μm）柱，以甲醇-0.4%磷酸溶液（7∶93）為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm，柱溫30 ℃。

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備。

精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.3 mg，用無水甲醇定容至50 ml棕色容量瓶中，配制成106 μg/ml（母液）的對(duì)照品溶液。放于4 ℃冰箱中，備用。

1.4.3 供試品溶液的制備。取盤龍七藥材，在60 ℃條件下烘干，粉碎過60目篩。稱取約0.5 g，精密稱定，置于具塞100 ml錐形瓶中，加40 ml 80%甲醇溶液和10 ml 25%的鹽酸溶液，在超聲功率為240 W、超聲頻率為40 kHz、溫度為60 ℃條件下，超聲提取120 min（超聲前浸泡30 min），取出，放冷，抽濾，將濾液用80%甲醇溶液定容至50 ml 容量瓶中，進(jìn)樣前用0.45 μm的濾膜過濾。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。準(zhǔn)確量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品母液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別用無水甲醇溶液定容至10 ml的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為5.3、10.6、21.2、31.8、42.4、53.0 μg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用以上6種不同濃度的溶液分別進(jìn)樣，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μl，進(jìn)樣前用0.45 μm的濾膜過濾，測(cè)定峰面積。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察 "由圖1可見，沒食子酸的回歸方程為Y=31 446X-15 550（R2=0.999 9），表明沒食子酸在5.3～53.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度試驗(yàn) 用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積并計(jì)算RSD。經(jīng)計(jì)算其峰面積RSD為0.35%，說明儀器的精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取盤龍七樣品5份，每份約0.5 g，均精

密稱定。按照“1.4.3”方

法制備供試液，按照“1.4.1”方法測(cè)

定，每份進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μl，根據(jù)峰面積計(jì)算沒食子酸的含量及RSD。結(jié)果顯示，5份樣品中沒食子酸的含量分別為1.664 4、1.694 6、1.707 8、1.660 2、1.729 5 mg/g，平均含量為1.691 3 mg/g，RSD為1.73%，表明該方法有較好的重復(fù)性。

注：圖中1為沒食子酸色譜峰。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 用盤龍七供試液分別于提取后0、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD。經(jīng)計(jì)算得沒食子酸峰面積的RSD為0.78%，說明盤龍七中沒食子酸供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取盤龍七樣品9份，各約0.25 g。按80%、100%、120%加入沒食子酸對(duì)照品，按“1.4.3”方法制備供試液和測(cè)定沒食子酸含量，并計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果顯示（表1），9組加樣回收率試驗(yàn)的平均回收率為99.995%，RSD為1.704%。

表1 沒食子酸加樣回收率試驗(yàn)（n=9）

編號(hào)取樣量

g樣品含量

mg添加標(biāo)品量

mg測(cè)得量

mg回收率

%回收率平

均值∥%RSD

%

10.250 30.423 30.339 20.761 699.71

20.249 80.422 50.339 20.762 8100.33

30.250 60.423 80.339 20.762 199.73

40.251 10.424 70.424 00.841 398.20

50.250 90.424 30.424 00.842 698.6599.9951.704

60.250 50.423 70.424 00.839 798.12

70.250 30.423 30.508 80.941 8101.91

80.250 70.424 00.508 80.949 5103.28

90.251 20.424 90.508 80.933 8100.04

2.6 不同產(chǎn)地盤龍七樣品中沒食子酸含量測(cè)定 稱取14個(gè)不同產(chǎn)地盤龍七樣品，每個(gè)產(chǎn)地樣品各3份，每份約0.5 g，均精密稱定。按照“1.4.3”方法制備供試液，按照“1.4.1”

方法測(cè)定，每份進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積，計(jì)算沒食子酸含量和RSD。由表2可知，14個(gè)不同產(chǎn)地盤龍七中沒食子酸含量為1.704 4～8.639 3 mg/g，不同產(chǎn)地盤龍七中沒食子酸含量差異明顯，文縣產(chǎn)盤龍七中沒食子酸含量最高（8.639 3 mg/g），鎮(zhèn)安縣產(chǎn)盤龍七中沒食子酸含量最低（1.704 4 mg/g），表明盤龍七中沒食子酸含量受產(chǎn)地、環(huán)境、氣候等因素的影響較大。樣品含量測(cè)定的色譜圖如圖3所示。

表2 不同產(chǎn)地盤龍七中沒食子酸含量（n=3）

藥材來源平均含量∥mg/gRSD∥%

洛南縣2.797 52.01

鎮(zhèn)安縣1.704 42.32

留壩縣3.012 31.69

洋縣3.918 11.77

勉縣2.292 91.58

鳳縣5.683 11.93

太白縣7.663 91.66

眉縣6.987 91.71

戶縣3.342 21.83

禮縣6.146 41.72

文縣8.639 31.95

宕昌縣8.037 61.89

九寨溝縣3.786 42.03

青川縣4.324 21.81

注：圖中1為沒食子酸色譜峰。

圖3 供試品色譜圖

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

應(yīng)用紫外可見分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)沒食子酸進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)沒食子酸在271 nm處有最大吸收峰，故選271 nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相比例的選擇

該試驗(yàn)曾比較過不同比例流動(dòng)相15∶85、13∶87、10∶90、9∶91、8∶92、7∶93（甲醇-0.4%磷酸溶液），當(dāng)流動(dòng)相的比例為7∶93時(shí)出峰效果較好。所以選擇7∶93（甲醇-0.4% 磷酸溶液）為該試驗(yàn)的流動(dòng)相比例。

3.3 提取溶劑的選擇

選用60%、80%的乙醇溶液和無水乙醇，對(duì)不同的溶劑提取做了對(duì)比研究。結(jié)果顯示80%的甲醇溶液和80%的乙醇溶液的提效果較好，但80%的甲醇溶液提取效果更好，所以選擇80%的甲醇溶液為提取溶劑。

3.4 提取時(shí)間的選擇

試驗(yàn)曾試過超聲提取30、60、90、120、150 min，結(jié)果表明提取時(shí)間為120和150 min時(shí)，所測(cè)含量相差很小;而提取時(shí)間為30、60、90時(shí)所測(cè)含量皆小于120和150 min，所以選擇提取時(shí)間為120 min。

3.5 提取溫度的選擇

由于甲醇的沸點(diǎn)為64.7 ℃，所以以60 ℃為起始溫度進(jìn)行溫度選擇試驗(yàn)，然后依次試了50、40、30 ℃。結(jié)果表明60 ℃提取效果最好，所以選60 ℃為超聲提取溫度。

3.6 提取次數(shù)的選擇

以料液比0.5∶50提取一次和0.5∶50提取兩次，數(shù)據(jù)結(jié)果未顯示出明顯差異，表明料液比為0.5∶50提取一次時(shí)盤龍七中的沒食子酸基本已被提盡。

4 結(jié)論

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，關(guān)于盤龍七中沒食子酸含量的測(cè)定尚未見報(bào)道。該研究以陜、甘、川三省14個(gè)不同產(chǎn)地的盤龍七為材料，研究了其中沒食子酸的含量。結(jié)果顯示，所測(cè)14個(gè)產(chǎn)地的盤龍七中沒食子酸的含量為1.704 4～8.639 3 mg/g，其中甘肅省隴南市文縣產(chǎn)盤龍七中沒食子酸含量為8.639 3 mg/g，為所測(cè)材料中沒食子酸含量最高值;且沒食子酸含量高于頭花蓼[5]、地錦草[6]、虎耳草[7]、草龍[8]、菱角[9]、葉下珠[10]、滇牡丹[11]等。該試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定盤龍七藥材中沒食子酸的含量，該方法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于不同產(chǎn)地盤龍七藥材的質(zhì)量控制，同時(shí)也可為其他植物中沒食子酸的檢測(cè)提供參考。沒食子酸作為一種重要的精細(xì)化學(xué)品， 在生物、 醫(yī)藥、 化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛， 可出口創(chuàng)匯， 有良好的發(fā)展前景。發(fā)展沒食子酸的生產(chǎn)關(guān)鍵之一是選取原料，可選用的原料有五倍子、塔拉、茶條槭葉等。目前國(guó)內(nèi)五倍子貨源緊張， 可再考慮選取其他材料。文縣產(chǎn)盤龍七中沒食子酸含量較豐富，具有進(jìn)一步的開發(fā)利用價(jià)值，可考慮作為沒食子酸的來源之一。

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