吳波 喻志陽 王玥坤 張伶俐 陳醒 魏瑋 高茗 藍(lán)曉紅

糖尿病腎病（Diabetic kidney disease, DKD）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計，我國DKD患病率在糖尿病患者中占30%～50%，且呈逐漸上升趨勢，成為終末期腎病的首位病因[1]。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為DKD的發(fā)病機(jī)制是由于機(jī)體糖代謝異常，血糖濃度過高促使腎臟血液動力學(xué)發(fā)生改變，腎小球濾過率降低，腎小管重吸收下降，出現(xiàn)蛋白尿、血尿、水腫等癥狀[2]。針對DKD的治療，糖尿病腎臟病防治指南及專家共識推薦控制血糖、血壓、血脂，減少尿蛋白為主，還包含生活方式干預(yù)、治療腎功能不全的并發(fā)癥以及透析治療等。降血糖藥物常用二甲雙胍，但因腎功能不全導(dǎo)致二甲雙胍無法排泄，易造成乳酸堆積，嚴(yán)重者可能發(fā)生乳酸性中毒；ARB/ACEI用于高血壓伴大量蛋白尿優(yōu)于其他降壓藥物，但容易造成高血鉀，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)心律失常，對伴有慢性心功能不全患者造成嚴(yán)重危害。中醫(yī)藥是我國文化瑰寶之一，其控制DKD的發(fā)展療效確切，因而不少學(xué)者提出將中醫(yī)與西醫(yī)結(jié)合診治DKD[3，4]。有研究顯示[5]，黃芪與黃蜀葵花配伍后，能顯著降低患者尿蛋白水平，延緩DKD的發(fā)展，但其作用機(jī)制及主要活性成分尚不清楚。作者借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)的方法，探究黃芪與黃蜀葵花配伍治療DKD活性成分、重要靶點及潛在信號通路，為臨床應(yīng)用和深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 常用數(shù)據(jù)庫及軟件 本研究用到的數(shù)據(jù)庫有：TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp search.php），String（https://cn.string-db.org/），David（https://david.ncifcrf.gov/），UniProt（https://www.uniprot.org/），Gene Cards（https://www.genecards.org/），GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https://www.rcsb.org/）。用到的軟件有：RStudio，R3.5，Cytoscape3.7，AutoDock4.6，SangBox，PyMol，OpenBabel。

1.2 黃芪、黃蜀葵花的活性成分及靶點 檢索中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）獲得黃芪、黃蜀葵花的化學(xué)成分，設(shè)置篩選條件為口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18。檢索活性成分作用的靶點信息，并在UniProt數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)換成靶點。

1.3 DKD相關(guān)靶點及差異基因的篩選 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中搜索“diabetic kidney disease”，獲得與DKD相關(guān)的靶點信息。在GEO數(shù)據(jù)庫中，搜索與DKD相關(guān)的芯片，并用GEO2R在線分析工具分析芯片數(shù)據(jù)，得到關(guān)于DKD的表達(dá)基因。設(shè)置P＜0.05，log|FC|≥1為篩選條件，獲得DKD差異表達(dá)基因。

1.4 “黃芪—黃蜀葵花—DKD—活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的活性成分及其對應(yīng)的靶點導(dǎo)入到Cytoscap3.7軟件，構(gòu)建“黃芪—黃蜀葵花—DKD—活性成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)。將活性成分對應(yīng)的靶點與GeneCards和GEO獲取的靶點放在一起，取交集，得到共同靶點，隨后構(gòu)建共同靶點與其對應(yīng)的活性成分網(wǎng)絡(luò)。

1.5 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 將共同靶點上傳到String數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人，選擇綜合得分（Combined score）＞0.4的連結(jié)關(guān)系，得到共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將String平臺得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7軟件，利用“Cytohubba”和“MCODE”插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選關(guān)鍵靶點。

1.6 關(guān)鍵靶點的GO分析和KEGG信號通路富集分析 在David數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵靶點，設(shè)置物種為人，基因表型為Office Gene Symbol，得到關(guān)鍵靶點的GO和KEGG富集通路。

1.7 關(guān)鍵靶點與活性成分的分子對接 用PyMol軟件將關(guān)鍵靶點（蛋白）去水分子和配體，用AutoDock進(jìn)行加氫，計算電荷，設(shè)置原子屬性，保存為pdbqt格式。在PubChem平臺上獲取活性成分或原配體的結(jié)構(gòu)式，保存2D SDF文件，同時用OpenBable轉(zhuǎn)換成mol2格式。利用AutoDock將活性成分或原配體進(jìn)行加氫，計算電荷，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，保存為pdbqt格式。設(shè)置GridBox的格子大小能包含靶點與化合物（原配體），運(yùn)算模式選擇馬克算法，保存為dpf格式。設(shè)置靶點為剛性分子，化合物（原配體）為對接分子，對接方法默認(rèn)，保存為gpf格式。最后查看dlg格式文件，打開靶點，進(jìn)行rank energy，獲得分子對接結(jié)果為pdbqt格式，用OpenBable轉(zhuǎn)換成pdb格式，用PyMol查看對接。

2 結(jié)果

2.1 黃芪、黃蜀葵花活性成分 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，設(shè)置口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，一共獲得22個活性成分，黃芪有18個，黃蜀葵花有5個，其中槲皮素存在于兩味藥中。見表1。

表1 黃芪和黃蜀葵花活性成分

2.2 差異表達(dá)基因的火山圖和熱圖 利用GEO2R在線分析平臺對GSE30529芯片兩組數(shù)據(jù)（DKD組、空白對照組）進(jìn)行分析，得到的結(jié)果用R語言中的“volcano”函數(shù)進(jìn)行火山圖繪制，所得結(jié)果見圖1A。將TCMSP、GeneCards和GEO數(shù)據(jù)庫得到的靶點取交集，獲得共同靶點，見圖1B；利用R語言“heatmap”函數(shù)對共同靶點進(jìn)行聚類分析，得到共同靶點的熱圖，見圖1C?；鹕綀D顯示樣本里的全部基因，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)，黑色表示差異不顯著；熱圖表示的是共同靶點基因在每個樣本里的表達(dá)情況。

圖1A GSE30529芯片火山圖

圖1B 共同靶點韋恩圖

圖1C 共同靶點熱圖

2.3 構(gòu)建黃芪、黃蜀葵花和糖尿病腎病的“活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)” 借助Cytoscape3.7分別構(gòu)建黃芪、黃蜀葵花的“活性成分—靶點”及“活性成分—DKD—共同靶點”網(wǎng)絡(luò)?！盎钚猿煞帧悬c”包含227個節(jié)點，494條邊，利用“Network Analyzer”插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，活性成分中槲皮素（MOL000098）和山奈酚（MOL000422）在網(wǎng)絡(luò)中的Degree排名最前，提示槲皮素和山奈酚可能是黃芪、黃蜀葵花主要的活性物質(zhì)（見圖2A）。隨后將化合物對應(yīng)的共同靶點挑選出來，用Cytoscape3.7構(gòu)建“活性成分—DKD—共同靶點”網(wǎng)絡(luò)（見圖2B），圖中包含25個節(jié)點，47條邊。

圖2A 活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)

圖2B 活性成分—DKD—共同靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將上述得到的共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，獲得共同靶點的蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3A），為了便于挖掘核心靶點，則將String數(shù)據(jù)的結(jié)果保存為csv格式，并借助Cytoscape3.7軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，為了排除計算結(jié)果的差錯，選取了“Cytohubba”和“MCODE”兩種算法進(jìn)行分析（見圖3B、3C），關(guān)鍵靶點涉及EGF、CASP3、CCL2、ICAM1、VCAM1、CXCL10、STAT1和SPP1。

圖3A 共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3B Cytohubba算法的關(guān)鍵基因

圖3C MCODE算法的關(guān)鍵基因

2.5 GO富集和KEGG通路分析 采用David數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡(luò)中19個靶標(biāo)蛋白對應(yīng)的基因進(jìn)行GO與KEGG通路富集分析，GO富集包含生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）。生物過程涉及細(xì)胞對環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對缺氧反應(yīng)、對脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞粘附、負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、血管生成負(fù)調(diào)控和對細(xì)胞外滲的正調(diào)控等；細(xì)胞成分涉及細(xì)胞外間隙、膜筏、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)和核質(zhì)等；分子功能涉及修復(fù)綁定、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、雄激素受體結(jié)合和相同蛋白結(jié)合等。選取P值排名前20的條目，用R語言繪制GO條目氣泡圖（見圖4A）。

KEGG富集到25條信號通路（P＜0.05），主要包括：腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路、癌癥通路、膀胱癌通路、Erb B通路、MAPK信號通路和Toll樣信號通路等（見圖4B）。

圖4A GO條目氣泡圖（前20）

圖4B KEGG信號通路氣泡圖（前20）

2.6 分子對接驗證 上述分析結(jié)果顯示槲皮素和山奈酚在黃芪、黃蜀葵花組方中起到主要作用，在PubChem數(shù)據(jù)中查詢兩種成分，與關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接（選取得分排在前四靶點蛋白），與原配體進(jìn)行比較，活性成分與1CAM1和EGF靶點對應(yīng)的蛋白結(jié)合更加緊密。槲皮素、山奈酚與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果可視化展示見表2、圖5。

表2 槲皮素、山奈酚與關(guān)鍵靶點分子對接（kcal/mol）

圖5 槲皮素、山奈酚與1CAM1和EGF蛋白分子對接圖

3 討論

中藥既可減少DKD患者尿蛋白，又可降低血糖、血肌酐、改善脂質(zhì)代謝，一定程度上延緩DKD的發(fā)生、發(fā)展[6，7]，被廣泛運(yùn)用于慢性腎臟病防治[8]。黃芪、黃蜀葵花不僅可以與其他中藥配伍使用，也可以作為單味藥使用[9,10]。黃芪作為傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有降血糖、抗病毒、抗氧化、清除自由基和調(diào)節(jié)免疫等多方面藥理作用[11]。何麗珍[12]將黃芪用于糖尿病腎病的輔助治療，將實驗組（黃芪結(jié)合西醫(yī)治療）與對照組（常規(guī)西醫(yī)治療）進(jìn)行比較，實驗組的尿蛋白、空腹血糖和血尿素氮顯著降低。路亮[13]通過對比治療組（黃芪湯聯(lián)合常規(guī)治療）與對照組（常規(guī)治療），發(fā)現(xiàn)治療組的24h尿蛋白定量、尿白蛋白/尿肌酐（UACRR）及血清炎癥遞質(zhì)低于對照組。黃蜀葵花具有清熱利濕、解毒排濁的功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有減輕DKD炎癥反應(yīng)、抑制纖維化細(xì)胞因子表達(dá)、改善微循環(huán)以及保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞等功效，廣泛運(yùn)用于DKD治療[14，15]。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)，分析預(yù)測黃芪、黃蜀葵花配伍治療DKD的潛在藥理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)兩味藥含有22個活性成分參與調(diào)控疾病，其中與DKD相關(guān)的主要活性成分是槲皮素和山奈酚，參與調(diào)控的關(guān)鍵靶點有19個，這些靶點基因主要集中在腫瘤壞死因子信號通路、乙型肝炎通路、甲型流感通路和癌癥通路等與腎小球上皮細(xì)胞生長、凋亡密切相關(guān)通路，此外，還富集了MAPK、Toll樣信號通路與炎癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示黃芪、黃蜀葵花配伍可能通過多成分、多靶點、多途徑的方式干預(yù)DKD的發(fā)展。

既往研究表明，槲皮素具有抗纖維化、抗氧化、抗過敏、抗血栓、抗炎、抗菌、抗病毒及清除體內(nèi)自由基等多方面的藥理作用[16]。陳晶波[17]研究吡格列酮與黃酮類藥物抑制2型糖尿病大鼠腎臟泛素蛋白酶復(fù)合體系統(tǒng)介導(dǎo)NF-κB活化時發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過改善糖脂代謝、降低氧化應(yīng)激、減少蛋白尿發(fā)生、抑制NF-κB p65表達(dá)等途徑減輕糖尿病大鼠腎臟病理改變，延緩疾病進(jìn)程。山奈酚又稱山奈黃素，廣泛存在于植物的根、葉和果實中，具有抗氧化、抗癌及預(yù)防心血管疾病等多種藥理活性[18]。孔令希[19]研究山奈酚抗動脈粥樣硬化作用機(jī)理及其藥代動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的山奈酚能顯著降低家兔血清血脂水平，與模型組比較，顯著下調(diào)血管炎性分子選擇素（E-sel）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）mRNA表達(dá)水平。

表2所示槲皮素、山奈酚與ICAM-1和EGF的結(jié)合程度高于原配體，推測兩種活性成分通過調(diào)控ICAM-1和EGF靶點來延緩DKD惡化發(fā)展。細(xì)胞間黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成員，在穩(wěn)定細(xì)胞間相互作用和促進(jìn)白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移起著重要作用，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)與活化、細(xì)胞組織生長、炎癥反應(yīng)及血管生成等生理病理過程。表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）是人體重要的細(xì)胞因子，參與調(diào)控表皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和愈合。圖1C所示DKD患者EGF表達(dá)低于正常組，提示DKD患者腎臟損傷修復(fù)下降。與此同時，ICAM-1表達(dá)高于正常組，提示DKD患者腎臟免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)高于正常組。此外，KEGG富集的主要通路是腫瘤壞死因子信號通路，該通路與DKD的發(fā)展有著密切聯(lián)系[20]。

本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)結(jié)合分析黃芪、黃蜀葵花治療DKD的作用機(jī)制，挖掘潛在的活性成分及作用靶點，并用分子對接技術(shù)驗證數(shù)據(jù)的可靠性，且預(yù)測數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致，具有一定的科學(xué)指導(dǎo)性?，F(xiàn)階段，山奈酚的臨床研究鮮有報道，能否用于臨床仍需加大研究樣本進(jìn)行臨床實驗驗證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的篩選是根據(jù)口服利用度和類藥性，其中可能忽略了其他的活性成分，隨著計算機(jī)技術(shù)和生物信息技術(shù)的發(fā)展，潛在的分子機(jī)制、作用靶點會逐漸被發(fā)現(xiàn)。