郭寶琴，魏暢，王軼南，李強(qiáng)

(1.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

魚類的免疫系統(tǒng)能在抵御病原入侵和感染疾病后的恢復(fù)上發(fā)揮重要作用，IgM是魚類特異性免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì)。目前，血清中抗體效價的高低已成為反映水生動物免疫水平較為理想的可靠指標(biāo)[1]，因此，建立檢測魚類血清中IgM抗體水平的方法，不僅有助于深入了解魚類體液免疫應(yīng)答規(guī)律，也可有效地監(jiān)測魚類疫苗的免疫效果，從而推動魚類疫苗的研制，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

單克隆抗體(monodonal antibody，Mab)具有均一性、高效性、特異性、生物活性的單一性及可無限供應(yīng)等特點，將單克隆抗體技術(shù)應(yīng)用于魚類IgM結(jié)構(gòu)與功能分析、病原與抗體檢測、疫苗研制及免疫應(yīng)答規(guī)律研究等方面具有科學(xué)理論意義和生產(chǎn)應(yīng)用價值[2]。近年來，世界范圍內(nèi)紛紛開始研制重要經(jīng)濟(jì)魚類IgM的單克隆抗體，并以此為工具，借助多種生物學(xué)技術(shù)對魚類體液免疫應(yīng)答機(jī)理及疫苗免疫效果評價等方面開展了廣泛研究[3-9]。

異育銀鯽Carassiusauratusgibelio具有生長快、抗逆性強(qiáng)和肉質(zhì)好等優(yōu)點，是主要的養(yǎng)殖鯽品種之一。關(guān)于異育銀鯽IgM的單克隆抗體已有學(xué)者開展了一些相關(guān)研究，但并未進(jìn)行商業(yè)化開發(fā)，僅限于在研究者所在的實驗室內(nèi)使用[3，10]。近年來，隨著異育銀鯽養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴(kuò)大、集約化程度的不斷提高，鯽魚養(yǎng)殖病害問題日益突出。鯽造血器官壞死病(俗稱鯽鰓出血病)，其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)，是2008年以來在中國江蘇、湖北、江西、浙江省等異育銀鯽養(yǎng)殖區(qū)新發(fā)的一種烈性傳染病，給養(yǎng)殖戶造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，對該病進(jìn)行早期診斷及免疫防控是控制該病蔓延的有效手段之一[11]。本研究中，通過分離純化得到異育銀鯽血清IgM，并以此為抗原免疫小鼠，制備其特異性單克隆抗體，利用制備的抗體構(gòu)建了一種鯽血清中CyHV-2特異性抗體酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，以期為今后開展異育銀鯽免疫應(yīng)答研究提供有力工具，為開展CyHV-2疫苗對異育銀鯽免疫效果的評價提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用異育銀鯽購于江蘇省大豐市某養(yǎng)殖場；試驗用SPF級BALB/c雌性小鼠購于大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；骨髓瘤細(xì)胞系(P3)購于武漢普諾賽生命科技有限公司；鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)及其滅活疫苗由鹽城工學(xué)院水產(chǎn)動物免疫與疾病實驗室分離制備。

RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑及堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記羊抗鼠Ig等均購自Sigma公司;異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗鼠Ig購自索萊寶公司；胎牛血清購自Gibco公司；Protein A親和層析柱購自上海碧云天有限公司。

1.2 方法

1.2.1 異育銀鯽血清IgM的純化 從健康異育銀鯽尾靜脈采血，室溫下放置1 h后置于4 ℃下過夜，次日以3 000g離心20 min，吸取上層血清。將血清與等體積PBS混合后，逐滴加入飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，使硫酸銨終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，充分?jǐn)嚢韬笥? ℃下靜置過夜；次日以12 000g離心30 min，收集沉淀；將沉淀溶解于適量0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液中，放入透析袋中，用相同緩沖液透析除去硫酸銨。透析后的樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，裝入已預(yù)先平衡好的Protein A親和層析柱中進(jìn)一步純化，具體方法參照產(chǎn)品說明書。收集樣品進(jìn)一步超濾濃縮，通過SDS-PAGE電泳測定IgM蛋白純度，使用Bradford法測定IgM蛋白濃度。

1.2.2 抗異育銀鯽IgM單克隆抗體的制備 以異育銀鯽IgM為抗原免疫4周齡BALB/c小鼠，末次免疫后第3天取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，具體免疫程序和細(xì)胞融合參照Li等[12]的方法。融合后待雜交瘤細(xì)胞群長到占96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔底1/3時，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行初篩。

ELISA檢測流程如下：用異育銀鯽IgM包被酶標(biāo)板，0.01 mg/孔，于4 ℃下過夜，用PBST洗滌3次，每次5 min；用體積分?jǐn)?shù)為3%的牛血清白蛋白(BSA)封閉，200 μL/孔，于37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌；加待檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對照)，100 μL/孔，于37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌；加AP標(biāo)記羊抗鼠Ig(1∶3 000稀釋)，100 μL/孔，于37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌；加100 μL pNPP底物液進(jìn)行顯色，避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測定吸光度值(OD405 nm)，當(dāng)陽性O(shè)D/陰性O(shè)D(P/N)>2.1時判定為陽性。

將陽性雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔擴(kuò)大培養(yǎng)后再次經(jīng)ELISA進(jìn)行檢測，利用有限稀釋法對結(jié)果呈陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，將克隆后的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。利用小鼠單抗Ig類/亞類進(jìn)行抗體亞型分析，用ELISA試劑盒(北京博奧龍)進(jìn)行鑒定，具體過程參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 單抗的Western blot分析 將純化的異育銀鯽IgM經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜(恒定電壓為100 V，90 min)，在4 ℃條件下用體積分?jǐn)?shù)5%的BSA封閉過夜;NC膜經(jīng)PBST洗滌后置于陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中(以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對照)，于37 ℃下孵育1 h;膜經(jīng)PBST洗滌后置于AP標(biāo)記羊抗鼠Ig(1∶3 000稀釋)中，于37 ℃下孵育1 h;膜再經(jīng)PBST洗滌后置于NBT-BCIP發(fā)色液中，顯色后用超純水清洗終止反應(yīng)，記錄反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4 單抗免疫熒光檢測 利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51%的Percoll(原濃度1.130 g/mL)分離健康異育銀鯽脾臟中白細(xì)胞，制作細(xì)胞滴片，用丙酮固定;細(xì)胞滴片上滴加陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對照)，于37 ℃下孵育1 h;滴片經(jīng)PBST洗滌后滴加FITC標(biāo)記羊抗鼠Ig(1∶256稀釋)，于37 ℃下孵育1 h;滴片再經(jīng)PBST洗滌后滴加Hoechst 33342復(fù)染，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 鯽血清中CyHV-2特異性抗體檢測技術(shù)的構(gòu)建

1)ELISA檢測流程。用CyHV-2包被酶標(biāo)板(2 μg/孔)，4 ℃下過夜，用PBST洗滌3次，每次5 min；用體積分?jǐn)?shù)為3%的牛血清白蛋白(BSA)封閉，200 μL/孔，于37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌；加待檢測異育銀鯽血清，100 μL/孔，于25 ℃下孵育2 h，用PBST洗滌；加抗異育銀鯽IgM單抗，100 μL/孔，于37 ℃下孵育1 h，用PBST洗滌；加AP標(biāo)記羊抗鼠Ig，100 μL/孔，于37 ℃ 孵育1 h，用PBST洗滌；加100 μL pNPP底物液進(jìn)行顯色，避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀測定吸光度值(OD405 nm)，當(dāng)P/N>2.1時判定為陽性。

2)最佳單抗的確定。以CyHV-2滅活疫苗注射免疫異育銀鯽21 d后的血清作為陽性血清(1∶50稀釋)，注射PBS的異育銀鯽血清作為陰性血清(1∶50稀釋)，分別以抗異育銀鯽IgM單抗8C5、8G1、7C6、5C2、8C2作為檢測單抗，AP標(biāo)記羊抗鼠Ig為二抗(1∶4 000稀釋)，按照上述構(gòu)建的ELISA技術(shù)進(jìn)行CyHV-2特異性抗體檢測。以P/N>2.1時判斷為陽性，以數(shù)值最高者為最佳單抗。

3)最佳二抗稀釋度的確定。以CyHV-2滅活疫苗注射免疫異育銀鯽21 d后的血清作為陽性血清(1∶50稀釋)，注射PBS的異育銀鯽血清作為陰性血清(1∶50稀釋)，以抗異育銀鯽IgM單抗8C5作為檢測單抗，分別以1∶2 000、1∶3 000和1∶4 000稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠Ig作為二抗，按照上述構(gòu)建的ELISA技術(shù)進(jìn)行CyHV-2特異性抗體檢測。以P/N>2.1時判斷為陽性，以數(shù)值最高者為最佳二抗稀釋度。

4)最佳鯽血清稀釋度的確定。以CyHV-2滅活疫苗注射免疫異育銀鯽21 d后的血清作為陽性血清(1∶10、1∶20、1∶50稀釋)，注射PBS的異育銀鯽血清作為陰性血清(1∶10、1∶20、1∶50稀釋)，以抗異育銀鯽IgM單抗8C5作為檢測單抗，以1∶2 000稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠Ig作為二抗，按照上述構(gòu)建的ELISA技術(shù)進(jìn)行CyHV-2特異性抗體檢測。以P/N>2.1時判斷為陽性，以數(shù)值最高者為最佳鯽血清稀釋度。

2 結(jié)果與分析

2.1 異育銀鯽血清IgM的純化

異育銀鯽血清經(jīng)硫酸銨鹽析、Protein A親和層析后，得到的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，呈現(xiàn)出2條主要蛋白條帶，相對分子質(zhì)量分別為82 000和25 000(圖1)，分別為異育銀鯽IgM的重鏈和輕鏈。樣品經(jīng)超濾濃縮后，通過Bradford法測得IgM蛋白質(zhì)量濃度約為1 mg/mL。

2.2 單抗的制備

細(xì)胞融合后，經(jīng)含HAT的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，有100余株雜交瘤生成，利用間接ELISA法篩選發(fā)現(xiàn),其中有20余株雜交瘤檢測結(jié)果均呈陽性。利用有限稀釋法對陽性雜交瘤克隆后，進(jìn)一步篩選獲得了5株穩(wěn)定分泌抗異育銀鯽IgM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為8G1、7C6、8C2、8C5、5C2(表1)。利用小鼠單抗Ig類/亞類，用ELISA試劑盒對5株單抗進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示，8G1、8C2、8C5和5C2均為IgG1亞型，7C6為IgG2b亞型。

M—標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1—純化的IgM。M—marker；1—purified IgM.圖1 異育銀鯽血清 IgM蛋白的電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE result of IgM protein from the serum of silver prussian carp

表1 異育銀鯽血清IgM單克隆抗體間接ELISA篩選結(jié)果Tab.1 Results of the anti-silver prussian carp IgM monoclonal antibody screening by indirect ELISA

2.3 單抗的Western blot分析

經(jīng)Western blot分析顯示，單抗8C5、5C2、8G1、8C2和7C6均可特異性識別相對分子質(zhì)量為25 000的IgM輕鏈分子(圖2)。

M—標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1—8C5；2—5C2；3—8G1；4—8C2；5—7C6；6—陰性對照。M—marker;1—8C5；2—5C2；3—8G1；4—8C2；5—7C6；6—negative control.圖2 抗異育銀鯽血清IgM蛋白的單抗免疫印跡結(jié)果Fig.2 Western blot of MAbs with purified IgM protein of silver prussian carp

2.4 單抗的免疫熒光檢測

利用Percoll試劑分離獲取健康異育銀鯽脾臟中白細(xì)胞，通過細(xì)胞滴片間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，單抗8C5、5C2、8G1、8C2和7C6均可與異育銀鯽脾臟中部分白細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，陽性細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色點狀熒光信號。圖3為單抗8C5的間接免疫熒光檢測結(jié)果。

A1、B1—白細(xì)胞Hoechst 33342染色；A2、B2—白細(xì)胞與單抗8C5或骨髓瘤上清反應(yīng)結(jié)果；A3、B3—A1與A2及B1與B2的組合；紅色箭頭指示陽性細(xì)胞。A1,B1—leukocytes staining with Hoechst 33342；A2,B2—leukocytes staining with MAb 8C5 or myeloma culture supernatant；A3,B3—merged of A1 and A2,B1 and B2；red arrows indicate the positive cells.圖3 單抗8C5的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig.3 Detection of MAb 8C5 by IFA

2.5 鯽血清CyHV-2特異性抗體檢測技術(shù)的構(gòu)建

1)最佳單抗的確定。試驗結(jié)果顯示，8G1、5C2、8C2、7C6和8C5均可識別鯽血清中CyHV-2特異性抗體，其中，8C5的檢測數(shù)值最高，因此，確定8C5為ELISA檢測方法中的最佳單抗(表2)。

表2 最佳單抗的確定Tab.2 Determination of the optimal monoclonal antibody

2)最佳二抗稀釋度的確定。以8C5作為檢測單抗，2 000、3 000、4 000倍稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠Ig作為二抗，通過ELISA技術(shù)檢測鯽血清中CyHV-2特異性抗體。結(jié)果顯示，3種稀釋度的二抗均可用于鯽血清中CyHV-2特異性抗體的檢測，其中以2 000倍稀釋的P/N值最高，故確定1∶2 000為ELISA檢測方法中的最佳二抗稀釋度(表3)。

表3 最佳二抗稀釋度的確定Tab.3 Determination of optimal dilution of secondary antibody

3)鯽血清最佳稀釋度的確定。以8C5作為檢測單抗，2 000倍稀釋的AP標(biāo)記羊抗鼠Ig作為二抗，通過ELISA檢測鯽血清中CyHV-2特異性抗體。結(jié)果顯示：將血清10倍稀釋時，陽性血清OD405 nm值最高，但陰性血清背景值偏高；將血清50倍稀釋時，陰性血清背景值較低，P/N值也最低；將血清20倍稀釋時，陰性血清背景值適中，P/N值與10倍稀釋時差異不大。因此，確定1∶20為ELISA檢測方法中鯽血清最佳稀釋度(表4)。

表4 鯽血清最佳稀釋度的確定Tab.4 Determination of the optimal dilution ratio of serum in silver prussian carp Carassius auratus gibelio

3 討論

3.1 鯽血清IgM蛋白的純化

硬骨魚類作為水生脊椎動物，應(yīng)對病原侵襲主要依靠自身的免疫系統(tǒng)，而IgM作為硬骨魚類血清中主要免疫球蛋白，是魚類特異性免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì)[13]。IgM的純化有助于開展其結(jié)構(gòu)及理論特性的研究，目前，針對鯽血清中IgM已成功建立了多種純化方式。沈錦玉等[3]利用山羊 IgG-瓊脂糖層析柱親和層析純化異育銀鯽IgM，獲得重鏈為75 000的IgM蛋白，但雜蛋白較多。陳垚等[14]利用飽和硫酸銨鹽析結(jié)合葡聚糖凝膠柱，分離純化異育銀鯽血清中IgM蛋白，獲得的IgM蛋白純度達(dá)80%以上，重鏈和輕鏈相對分子質(zhì)量分別為79 000和25 000。Wu等[10]利用飽和硫酸銨鹽析、DEAE瓊脂糖層析柱提取純化異育銀鯽血清中IgM，獲得的IgM蛋白純度高，無明顯雜蛋白，重鏈和輕鏈相對分子質(zhì)量分別為74 000和24 000。吳光輝等[15]通過ProteinA親和層析法純化異育銀鯽血清中IgM蛋白，獲得的IgM蛋白重鏈和輕鏈清晰可辨，相對分子質(zhì)量分別為85 000和25 000，無明顯雜蛋白。本試驗中，通過飽和硫酸銨鹽析、Protein A親和層析提取純化異育銀鯽血清中IgM蛋白，獲得的IgM蛋白純度高，無明顯雜蛋白，重鏈和輕鏈相對分子質(zhì)量分別為82 000和25 000，重鏈和輕鏈分子量與以往報道基本一致。

3.2 魚血清IgM單克隆抗體的制備

單克隆抗體具有純度高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、交叉反應(yīng)少和制備成本低等優(yōu)點，已成為研究魚類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)及功能的重要工具。目前，已成功研制出歐洲鰻Anguillaanguilla、南方鲇Silurusmeridionalis、羅非魚Silurusmeridionalis、大菱鲆Scophthalmusmaximus、鲇Clariasmacrocephalus、羅湖鯉Labeorohita和鯽等[3-9]多種魚類血清IgM單克隆抗體，其主要識別IgM重鏈分子。本試驗中，以純化的異育銀鯽IgM蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和有限稀釋克隆共獲得了5株穩(wěn)定分泌抗異育銀鯽IgM單抗的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)Western blot鑒定顯示，5株單抗均可與變性條件下的異育銀鯽IgM輕鏈分子發(fā)生特異性結(jié)合，說明這5株單抗識別的抗原決定簇位于異育銀鯽IgM輕鏈分子上，這與沈錦玉等[3]和Wu等[10]的研究結(jié)果有所不同，后者制備的鯽血清IgM單抗識別的抗原決定簇位于IgM重鏈。與哺乳類等高等動物相似，魚類B淋巴細(xì)胞表面也存在膜結(jié)合型免疫球蛋白(sIgM)，利用識別sIgM的單抗可以對淋巴細(xì)胞亞群及其生物學(xué)活性進(jìn)行分析[16]。本研究中，間接免疫熒光分析顯示，5株單抗均可與異育銀鯽脾臟中部分白細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，陽性細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色點狀熒光信號，說明5株單抗均可識別異育銀鯽組織內(nèi)淋巴細(xì)胞表面的sIgM分子，這為進(jìn)一步研究淋巴細(xì)胞針對抗原刺激的免疫應(yīng)答提供了有效的細(xì)胞示蹤工具。

3.3 魚血清IgM單克隆抗體的應(yīng)用

以魚類IgM單抗作為檢測工具，通過ELISA技術(shù)檢測魚類血清中病原特異性抗體，可進(jìn)行疾病的輔助診斷和疫苗的免疫效果評價。Li等[17]以抗鯉IgM單抗為一抗，建立了鯉Cyprinuscarpio血清中KHV特異性抗體的間接ELISA檢測技術(shù)，利用此技術(shù)對200份疑似感染KHV樣品檢測，陽性檢出率為26.5%，而PCR陽性檢出率為16.5%。Zeng等[18]在以抗草魚IgM單抗為一抗，開發(fā)了一種草魚Ctenopharyngodonidella血清中GCRV-Ⅱ特異性抗體的間接ELISA檢測技術(shù)，利用此技術(shù)對242份血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，陽性率為69.8%，此方法可用于檢測魚體是否感染GCRV-Ⅱ，起到監(jiān)測草魚體內(nèi)抗體水平變化的作用。Faisal等[19]以抗北美狗魚IgM單抗為一抗，建立了北美狗魚Esoxmasquinongy血清中VHSV-IVB特異性抗體的間接ELISA檢測技術(shù)，并使用該技術(shù)對VHSV-IVB DNA疫苗注射后北美狗魚體內(nèi)的抗體水平進(jìn)行了評估，結(jié)果表明，此方法可以很好地檢測到接種VHSV-IVB DNA疫苗后北美狗魚體內(nèi)特異性抗體水平動態(tài)變化。鯽造血器官壞死病傳染速度快、致死率高，是2008年以來制約中國鯽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最主要的病毒病。為有效防治該病，國內(nèi)外眾多研究單位已開始進(jìn)行疫苗攻關(guān)，包括日本東京水產(chǎn)研究所研制的滅活疫苗[20]、浙江省淡水水產(chǎn)研究所研制的滅活疫苗[21]、中國水產(chǎn)科學(xué)院長江水產(chǎn)研究所制備的弱毒疫苗[22]、中國科學(xué)院水生生物研究所研制的重組亞單位疫苗[23]和蘇州大學(xué)制備的DNA疫苗[24]等。目前，針對這些疫苗的免疫效果評價主要采用攻毒感染的方式進(jìn)行，缺少從特異性抗體水平層面的效果評價。本研究中建立的間接ELISA檢測技術(shù)，可有效檢測鯽血清中CyHV-2特異性抗體，為今后CyHV-2疫苗的效果評價奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

1)本研究中純化得到了重鏈、輕鏈相對分子質(zhì)量分別為82 000和25 000的異育銀鯽IgM蛋白，制備了5株抗異育銀鯽IgM單克隆抗體，經(jīng)鑒定,所制單抗均可以特異性識別IgM蛋白輕鏈。

2)以所制單抗為檢測工具構(gòu)建了檢測鯽血清中CyHV-2特異性抗體的間接ELISA技術(shù)，為CyHV-2疫苗的開發(fā)及其在異育銀鯽養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供了免疫效果評價工具。