徐敏慧，Josee Ornella Musaniwabo ，韓少凡，劉一涵，杜麗樺，劉愛玉，汪啟明，屠小菊

(1.湖南農業(yè)大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業(yè)大學 農學院，湖南 長沙 410128)

種子萌發(fā)關系著物種的生存和繁衍，細胞分裂素(Cytokinin，CK)等植物激素作為一種小分子信號物質，在濃度極小時仍對種子萌發(fā)具有舉足輕重的作用[1]。細胞分裂素的作用涉及包括細胞分裂與分化及種子萌發(fā)和果實發(fā)育等許多方面[2-4]，它可通過拮抗ABA信號加快種子萌發(fā)[5-7]，且這種拮抗作用依賴于細胞分裂素受體CRE1以及下游組氨酸磷酸轉移蛋白等[7]。在種子發(fā)育的早期階段，添加一定濃度的細胞分裂素能加速萌發(fā)[8]，這一時期，細胞分裂素水平暫時升高，還能最終決定種子大小[2，9]。

CRE1可能是表達最強的細胞分裂素受體，它是細胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)所必需的[10-11]，大多數已知的CRE1基因突變不會導致較強的植物形態(tài)表型[9，12]，但會改變生理參數，如磷酸鹽饑餓反應和硫酸鹽獲取的調節(jié)[12-13]。Tran等[14]研究發(fā)現，擬南芥(Arabidopsisthaliana)CRE1的T-DNA插入突變體種子萌發(fā)勢稍低于野生型，但是未見陸地棉(GossypiumhirsutumLinn)CRE1基因調控種子萌發(fā)的報道。

CRISPR/Cas9技術提供了一種直接的方法，可以精確設計基因組中所需的突變，且可篩選到不含外源基因的突變體，已成為基因功能研究的重要工具[15]。Wang等[16]利用CRISPR/Cas9技術對西瓜(Citrulluslanatus)Clbg1基因進行了靶向突變，發(fā)現Clbg1功能缺失型突變體萌發(fā)率顯著提高。Zhou等[17]利用CRISPR/Cas9技術構建水稻(Oryzasativa)Os05circ02465基因功能缺失型突變體，發(fā)現其種子萌發(fā)后生長速度加快。Shi等[18]利用CRISPR/Cas9技術敲除煙草(Nicotianatabacum)NtCIPK23基因，發(fā)現敲除突變體顯著延遲了種子萌發(fā)時間。

本研究以陸地棉細胞分裂素受體基因GhCRE1為研究對象，通過克隆該基因，構建棉花GhCRE1過表達載體，轉化擬南芥獲得過表達轉基因株系。采用最新的CRISPR/Cas9 基因編輯技術獲得擬南芥CRE1功能缺失突變體，通過對過表達株系及功能缺失株系的表型觀察，解析GhCRE1基因在調控植物生理過程中的功能，旨在為進一步研究陸地棉GhCRE1基因的功能提供植物材料，為明確植物萌發(fā)的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試棉花品種為陸地棉矮化突變體陸矮1號(LA-1)，由湖南農業(yè)大學棉花研究所提供。大腸桿菌菌株DH5α和農桿菌菌株GV3101均購自長沙擎科生物技術有限公司。載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-B、pYLsgRNA-AtU6-1、pYLsgRNA-AtU3d-LacZ、pCUbi1390由華南農業(yè)大學劉耀光院士實驗室贈送，擬南芥野生型Col-0由湖南農業(yè)大學道地藥用植物規(guī)范化栽培與利用湖南省工程實驗室贈送。

1.2 試驗方法

1.2.1 陸地棉GhCRE1基因的克隆 使用TRIzol提取法獲得純度較高的陸地棉總RNA，反轉錄獲得全cDNA。利用擬南芥中的CRE1基因序列，在NCBI數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)及COTTONGEN數據庫(www.cottongen.org)中進行同源比對，選取2個數據庫中相同序列信息，使用Primer Premier 5.0設計并在NCBI中驗證獲取特異性引物序列GhCRE1-F/R。以cDNA為模板，以GhCRE1-F/R為引物進行PCR反應擴增GhCRE1全長，引物序列為GhCRE1-F：5′-TACCCAGAATTCAACGTTGTCTCG-3′，GhCRE1-R：5′-CTATGAGTCCGAGATGGGTTTCG-3′，反應產物通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；產物回收純化后，連接T clone載體轉化大腸桿菌進行菌落PCR，選擇陽性克隆測序，確定獲得GhCRE1基因cDNA序列具有完整的開放閱讀框。

1.2.2 重組過表達載體的構建 將pCUbi1390載體用PstⅠ酶切，以含有目的基因重組T clone載體質粒為模板進行PCR擴增，PCR產物純化后與線性表達載體進行無縫克隆(圖1)。將無縫克隆后的表達載體轉化到大腸桿菌，挑選單克隆菌落進行PCR，選擇陽性單克隆提取質粒，采用酶切及測序的方法進行驗證。驗證引物序列為：GhCRE1-CDS-F：5′-GCTTTGGGTAATGGTGATG-3′，GhCRE1-CDS-R：5′-CAATAAGCAGATCACGAAGAATAAG-3′。

圖1 重組GhCRE1過表達載體構建方法示意Fig.1 Schematic diagram of construction method of recombinant GhCRE1 overexpression vector

1.2.3 擬南芥GhCRE1基因過表達株系的篩選 構建的過表達載體用凍融法轉化農桿菌GV3101，隨后用浸花法侵染花蕾期的擬南芥Col-0，收獲T0種子。T1潮霉素篩選具有抗性的植株，利用驗證引物GhCRE1-CDS-F/R進行PCR檢測，得到陽性植株，同樣的方法篩選至純合子。以Actin11為內參，設計qPCR引物GhCRE1-qF/R，檢測GhCRE1基因的表達量，篩選表達量高的株系進行后續(xù)試驗，引物序列如表1。

表1 擬南芥GhCRE1過表達材料的篩選與鑒定引物Tab.1 Primers used in screening and identification of Arabidopsis GhCRE1 overexpression plants

1.2.4 擬南芥CRE1靶向敲除載體構建 sgRNA靶向確定和引物設計：對擬南芥CRE1基因的ORF的5′區(qū)及功能區(qū)均設計一個靶位點，以提高突變效率。利用軟件CRISPR-P設計擬南芥CRE1靶位點分別為：靶位點1：ATCCTCTCACAACTCATTAC位于5′UTR區(qū)，GC含量40%，選用AtU3d-LacZ作為啟動子；靶位點2：GCTGCTGCGTTTGAAAGAAA位于外顯子區(qū)域，GC含量45%，選用 AtU6-1作為啟動子。采用Overlapping PCR的方法分別將2個靶位點序列引入PCR正向及反向引物中，并引入依次排列的BsaⅠ酶切位點至引物5′端，獲得所需 sgRNA。相應的引物如表2。

表2 sgRNA表達盒引物Tab.2 Primers used in construction of sgRNA expression cassette

CRISPR/Cas9基因敲除載體的構建：使用限制性內切酶BsaⅠ酶切pYLCRISPR/Cas9質粒，酶切產物經電泳后切膠回收。采用Golden Gate cloning(NEB)的方法，利用T4連接酶將pYLCRISPR/Cas9線性化載體分別與CRE1的2個sgRNA表達盒片段組裝。將重組載體轉入大腸桿菌DH5α，使用含相應抗生素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落PCR篩選陽性菌。利用各靶點引物特異性，對陽性菌進行靶位點測序，采用的引物為SP-L與SP-R，序列如下：SP-L：GCGGTGTCATCTATGTTACTAG，SP-R：CCCGACATAGATGCAATAACTTC。

1.2.5 擬南芥CRE1基因編輯植株的獲得及篩選 將構建的敲除載體利用凍融法轉化農桿菌GV3101，用浸花法侵染花蕾期的野生型擬南芥Col-0。收集得到T0種子。使用引物CRE1T1-F/R和CRE1T2-F/R對T0植株分別進行PCR擴增，獲得的擴增片段切膠回收后測序檢測，測序結果顯示，在靶位點處為套峰的，對其相應的植株進行單株收種并檢測編輯效果。逐代篩選后，使用CRE1功能缺失型突變體純合子進行后續(xù)試驗，測序引物見表3。

表3 擬南芥CRE1基因編輯植株的篩選與鑒定Tab.3 Primers used in screening and identification of of CRE1 gene editing plants

1.2.6 種子萌發(fā)試驗 將篩選得到的GhCRE1過表達轉基因株系、擬南芥CRE1基因編輯突變體及野生型Col-0 各50顆點種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上，并在4 ℃下春化3 d后轉入22 ℃ 16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，每天固定時間檢測種子萌發(fā)勢，每個處理3個重復。數據均采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，并用Origin 2019b作圖。

2 結果與分析

2.1 陸地棉GhCRE1基因過表達轉基因株系構建

2.1.1GhCRE1基因克隆 以擬南芥CRE1基因序列為模板，Blast比對得到陸地棉該基因序列，以陸地棉葉片為材料，液氮研磨后提取RNA，并反轉錄為cDNA。以陸地棉cDNA為模板，以GhCRE1-F及GhCRE1-R為引物進行PCR擴增得到GhCRE1基因編碼序列的CDS片段。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示(圖2)，PCR擴增得到3 000 bp左右條帶，將擴增產物純化后測序發(fā)現，克隆的基因長度為3 012 bp，克隆得到的條帶與目的條帶一致，結果表明，成功克隆了GhCRE1-CDS片段。

M.DNA Marker DL1000；1，2.GhCRE1-CDS片段。M.DNA Marker DL1000；1，2. GhCRE1-CDS segment.

2.1.2GhCRE1基因過表達載體的構建 根據GhCRE1序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物驗證無縫克隆后的過表達載體陽性單克隆，如圖3-A所示，將重組載體轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)后，用上述檢測引物進行菌落PCR，所有菌落均擴增獲得長913 bp的條帶，將重組質粒用PstⅠ酶切后獲得3 012 bp的條帶(圖3-B)，測序結果顯示，GhCRE1-CDS已插入pCUbi1390過表達載體，且無堿基突變，以上結果均符合預期，表明GhCRE1重組過表達載體構建成功。

A.重組載體菌落PCR：M.DNA Marker DL2000；1—8.菌落PCR檢測。B.重組質粒電泳及Pst Ⅰ酶切重組質粒：M.DNA Marker DL10000；1.Pst Ⅰ酶切重組質粒；2.重組質粒。

2.1.3 陽性擬南芥GhCRE1過表達材料的獲得及篩選 將得到的重組質粒使用農桿菌介導法轉化擬南芥Col-0，潮霉素篩選后獲得的T0植株，經選取新鮮葉片提取DNA及引物GhCRE1-CDS-F/R序列擴增，共獲得7個陽性株系(圖4-A)。以Actin11為內參，進行qPCR分析后，選擇GhCRE1相對表達量高的株系GhCRE1 5-1 與GhCRE1 9-2進行后續(xù)試驗(圖4-B)。

A.T0植株PCR檢測：M.DNA Marker DL2000；1—7.GhCRE1 過表達檢測PCR電泳條帶。B.qPCR檢測GhCRE1相對表達量。A.PCR assay of T0 generation plants：M.DNA Marker DL2000；1—7.PCR electrophoresis bands for GhCRE1 overexpression detection.B.qPCR assay of GhCRE1 relative expression.

2.2 擬南芥CRE1靶向敲除載體材料構建

2.2.1 基因編輯靶位點的選擇及敲除載體的構建 根據CRISPR-P軟件分析及CRE1基因序列分析，設計sgRNA序列分別為sgRNA-tg1：ATCCTCTCACAACTCATTACAGG(劃線部分為靶位點1)；sgRNA-tg2：GCTGCTGCGTTTGAAAGAAACGG(劃線部分為靶位點2)。靶位點1位于5′UTR區(qū)，選用AtU3d-LacZ作為啟動子，靶位點2位于外顯子區(qū)，選用 AtU6-1作為啟動子。

分別將靶位點1和靶位點2通過Overlapping PCR的方法與PYLsgRNA-AtU6-1、pYLsgRNA-AtU3d-LacZ中間載體連接。第一輪Overlapping PCR(圖5-A)，出現3條帶，所需的條帶為453 bp，泳道3和4分別為CRE12個靶位點的特異性產物。第二輪Overlapping PCR過后(圖5-B)，453 bp的條帶更清晰。隨后PCR增加BsaⅠ 酶切位點(圖5-C)，將重組后的2個中間載體分別連接T clone載體，之后轉大腸桿菌，菌落PCR擴增結果見圖5-D，表明重組中間載體構建成功。

M.DNA Marker DL2000；A.第一輪Overlapping PCR；B.第二輪Overlapping PCR：泳道3和4分別為CRE1-tg1和CRE1-tg2；C.增加Bsa Ⅰ酶切位點后跑膠；D.菌落PCR。M.DNA Marker DL2000；A.First round of Overlapping PCR；B.Second round of Overlapping PCR：lanes 3 and4 are CRE1-tg1 and CRE1-tg2；C.Running gel after addition of the Bsa Ⅰ digestion site；D.Colony PCR.

BsaⅠ酶切終載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-B(圖6-A)，重組中間載體連接后轉化大腸桿菌，利用SP-L及SP-R這一對檢測引物進行PCR擴增，產生與預計大小一致的目的片段(圖6-B)，可見擬南芥CRE1雙靶點敲除載體初步構建成功，將該載體命名為PYLCas9-CRE1-T1/T2。

M.DNA Marker DL2000；A.BsaⅠ酶切pYLCRISPR/Cas9；B.菌落PCR。M.DNA Marker DL2000；A.pYLCRISPR/Cas9 was digestion by BsaⅠ；B.Colony PCR.

載體PYLCas9-CRE1-T1/T2經序列比對發(fā)現，sgRNA已插入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B線性化基因編輯載體，且無堿基突變，表明靶向CRE1基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體構建成功(圖7)。

序列標記的陰影矩形部分為靶位點DNA序列(上為靶位點1，下為靶位點2)。The target DNA sequence is labeled with shadow rectangles(the top is target site 1，bottom is target site 2).

2.2.2 擬南芥CRE1靶向敲除材料的構建 T0植株經除草劑初篩后共獲得27株生長良好的株系，經測序后發(fā)現4個株系(CRE1 T0-14、CRE1 T0-18、CRE1 T0-22、CRE1 T0-27)在靶位點1處測序結果為疊峰，說明這4個株系在靶位點1處發(fā)生了突變。經生物信息學分析得知，這4個株系均在靶位點處缺失了1個堿基T(圖8)，導致轉錄提前終止，造成擬南芥CRE1的功能缺失型突變。因為這4個株系編輯效果一致，篩選到純合子后，采用cre127-1進行后續(xù)種子萌發(fā)試驗。

紅色標志序列部分ATCCTCTCACAACTCATTAC為靶位點1。The red marker sequence part ATCCTCTCACAACTCATTAC is the target site 1.

2.3 陸地棉GhCRE1基因影響擬南芥種子萌發(fā)

如圖9所示，在1/2 MS 培養(yǎng)基中，相比野生型，cre127-1萌發(fā)率在第1天低9%左右，第2，3天低15%左右差異均達到顯著水平(P<0.05)；與野生型相比，GhCRE1 5-1與GhCRE1 9-2第2天萌發(fā)率分別高近15%與11%，差異達到顯著水平(P<0.05)。因此，擬南芥CRE1功能缺失會導致種子萌發(fā)速度明顯減慢，而陸地棉GhCRE1基因在擬南芥中過表達能顯著加快種子萌發(fā)速度。

A.CRE1基因各突變體萌發(fā)勢；B.CRE1基因各突變體種子萌發(fā)表型。A.Germination potential of each CRE1 mutant；B.Seed germination phenotype of each CRE1 mutant.

3 結論與討論

作為植物必需的激素之一，細胞分裂素能調節(jié)諸如細胞分裂、組織和器官以及個體的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收等過程[19]。組氨酸激酶(CRE1)作為細胞分裂素的重要受體，對細胞分裂素信號轉導途徑中信息的傳遞具有重要的調節(jié)作用。但是，CRE1在調控除擬南芥之外的包括陸地棉等物種的種子萌發(fā)中的功能還未見相關的報道。因此，本試驗研究陸地棉GhCRE1基因在種子萌發(fā)中的功能具有重要的意義。

本研究首次成功克隆了陸地棉GhCRE1基因，并獲得GhCRE1的過表達擬南芥植株和CRE1基因編輯擬南芥。通過表型驗證發(fā)現，CRE1對啟動種子萌發(fā)具有正調控作用，為進一步研究陸地棉GhCRE1基因的功能提供植物材料，為明確植物萌發(fā)的分子機理奠定基礎。

值得注意的是，湖南農業(yè)大學棉花研究所前期針對目前陸地棉矮稈種質資源匱乏的問題，通過對陸地棉矮化突變體陸矮1號(LA-1)和高稈近等基因系(LH-1)的研究，篩選得到陸地棉細胞分裂素受體基因(CRE1)與LA-1的矮化密切相關。但本試驗經過對陸地棉GhCRE1過表達擬南芥成苗株高的測量，未觀測到矮化現象，且在正常生長條件下，未觀察到GhCRE1過表達擬南芥、CRE1基因編輯擬南芥在其他生長發(fā)育方面的差別，說明GhCRE1可能不參與調控擬南芥株高等生長發(fā)育的表型。

種子萌發(fā)受復雜的信號網絡和基因表達調控，不同植物可能具有相似的分子機制，包括植物激素的調節(jié)、環(huán)境因素等[20]。湖南農業(yè)大學棉花研究所在培養(yǎng)基中添加不同濃度的外源脫落酸(Abscisic acid，ABA)處理本研究獲得的擬南芥GhCRE1過表達種子及基因編輯突變體擬南芥cre127-1種子，結果發(fā)現，在外源ABA存在下，GhCRE1過表達種子比野生型萌發(fā)速度更慢，而突變體萌發(fā)速度相比野生型更快。眾所周知，細胞分裂素與脫落酸具有拮抗作用[21]，有研究發(fā)現，CK缺乏增加了植物對外源ABA的敏感性，但它也能導致ABA生物合成關鍵基因的下調，從而使CK缺乏植株的內源ABA，水平明顯低于野生型[22]。因此，推測GhCRE1過表達擬南芥對外源ABA更敏感，而CRE1缺失突變體通過降低內源ABA的合成從而影響萌發(fā)勢。本研究發(fā)現，外源ABA和CRE1能共同調控種子萌發(fā)，接下來會針對其調控的具體分子機制進行進一步的研究。這一發(fā)現有助于進一步了解脫落酸和細胞分裂素的拮抗作用發(fā)生機制。后期本課題組會將該基因轉入陸地棉中，進一步驗證該基因在調控棉花種子萌發(fā)及其他生理過程中的功能。