朱偉，沈愛國*，胡繼明

(1.武漢大學(xué)印刷與包裝系，武漢 430079;2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)

1 引言

光學(xué)顯微鏡的革新，極大地?cái)U(kuò)展了我們在微觀層面的認(rèn)知，也激發(fā)了研究者們對生物奧秘的不斷探索[1-2]。近年來，共聚焦拉曼顯微成像技術(shù)在分子生物學(xué)分析、疾病診斷和藥物發(fā)現(xiàn)等方面取得了很大進(jìn)展[3-6]。然而生物分子的拉曼散射收集信號的靈敏度低，拉曼譜圖的對目標(biāo)物的選擇性差，并且生物的拉曼圖譜解析復(fù)雜。因此，基于拉曼的光學(xué)標(biāo)簽作為生物醫(yī)學(xué)中的示蹤劑得到了廣泛的研究，尤其是三鍵(炔基、氰基等)標(biāo)記技術(shù)具備無生物內(nèi)源性干擾的優(yōu)勢而得到了研究者們的重視。三鍵的拉曼標(biāo)簽“點(diǎn)亮”了細(xì)胞中葡糖糖、DNA、蛋白質(zhì)等生物分子和多個(gè)細(xì)胞器的“蹤跡”，又實(shí)現(xiàn)了生物目標(biāo)物的精確定量檢測[7-8]。

值得關(guān)注的是，三鍵的拉曼散射峰小于2 nm，有望突破復(fù)雜生物系統(tǒng)中標(biāo)記的“顏色極限”而被用于生物多元甚至高通量的標(biāo)記研究，這也需要大量的可辯析的拉曼標(biāo)簽，且標(biāo)簽的信號輸出與目標(biāo)物能一一對應(yīng)。然而，目前基于三鍵拉曼位移不同而制備的三鍵標(biāo)簽難以進(jìn)一步突破“顏色極限”，其復(fù)雜的有機(jī)合成限制著不同三鍵信號分子用作三鍵標(biāo)簽的發(fā)展。還有一個(gè)重要的問題在于小分子的三鍵標(biāo)簽的信背比低，這難以實(shí)現(xiàn)有效的標(biāo)記研究[9-12]。因此尋找新的光譜方法和開發(fā)特定的光學(xué)標(biāo)簽迫在眉睫。

基于此，我們提出了一種拉曼強(qiáng)度編碼策略來合成具有可區(qū)分拉曼光譜信號輸出的三鍵納米標(biāo)簽。首先，通過改變含有三鍵的單體的分子結(jié)構(gòu)，可以很容易地合成出不同的聚合物；其次，通過兩種單體共聚并對所得信標(biāo)的拉曼強(qiáng)度進(jìn)行編碼，設(shè)計(jì)出更多可用的標(biāo)簽。此外，利用丙烯酸作為另一種單體共聚形成的，聚合物可以負(fù)載大量的羧基，特定的細(xì)胞靶向分子通過氨基和羧基的反應(yīng)可修飾到這些聚合物的表面，制備的三鍵聚合物可應(yīng)用于細(xì)胞的識別和成像。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 原料和試劑

4-乙烯基-2-甲氧基-苯甲腈為實(shí)驗(yàn)室自己合成。氰基苯乙烯、丙烯氰、丙烯酸、N-(2-氨基乙基)-4-甲基-苯磺酰胺、2-氨乙基-三苯基溴化瞵，N, N-二甲基-乙二胺、葉酸都購買于sigma公司；1-乙基-(3 -二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、偶氮二異丁腈(AIBN)、十二烷基硫酸鈉購買于中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。所有試劑都是分析純以上，實(shí)驗(yàn)中可直接使用，無需進(jìn)一步純化。

2.2 三鍵聚合物的合成

選擇即含三鍵(氰基)又含乙烯基的小分子為聚合物的單體，采用乳液聚合的方式將分子結(jié)構(gòu)不同的含三鍵單體聚合組裝成乳膠粒。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：4-乙烯-2-甲氧基-苯甲腈(0～50 mg)、氰基苯乙烯(0～50 mg)、丙烯氰(0～50 mg)和丙烯酸(10 mg)加入50 mL的三口圓底燒瓶后加入10 mL水，室溫?cái)嚢?800 r/min)；隨后于混合液中加入1 mL的十二烷基硫酸鈉(2 mg/mL)于混合液中，室溫?cái)嚢?0分鐘(800 r/min)；同時(shí)通入高純N2排除體系中多余的氣體，油浴加熱至70℃時(shí)，加入0.6 mL AIBN溶液(10 mg/mL, DMSO)引發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)2 h后，所得淡藍(lán)色乳液即為三鍵聚合物標(biāo)簽。反應(yīng)后，待乳液自然冷卻到室溫，采用透析除雜的方式對合成的聚合物乳液進(jìn)行純化處理，乳液裝入透析袋中(3500 Da)，每隔6 h換水，透析一周后保存在4℃冰箱備用。

2.3 用于活細(xì)胞中細(xì)胞器多色成像的拉曼標(biāo)簽的合成

用于細(xì)胞器成像的拉曼標(biāo)簽合成步驟如下：分別取2 mL上述四種不同的乳液于10 mL玻璃瓶中，放入磁子攪拌(600 r/min)，陸續(xù)加入20 mL的EDC(5 mg/mL)和20 mL的NHS(4 mg/mL)溶液，室溫下緩慢攪拌30 min；選擇靶向細(xì)胞器且?guī)в邪被姆肿蛹尤肷鲜龌旌弦褐?，具體對應(yīng)的分子修飾如圖3-1所示，N-(2-氨基乙基)-4-甲基-苯磺酰胺(5 mg)加入上述P1乳液中，(2-氨乙基)三苯基溴化瞵(2 mg)加入上述P2乳液中，N, N-二甲基乙二胺(5 mg)加入P3乳液中，葉酸(2 mg)加入P8乳液中；室溫?cái)嚢?2 h之后，將所形成的拉曼標(biāo)簽放入透析袋(截留3500 Da分子)中透析除雜，每隔6 h換水，透析3天；最終產(chǎn)物于4℃保存，供后續(xù)使用和表征。標(biāo)簽命名如下：ER-P1，Mito-P2，Lyso-P3，CM-P8，分別對應(yīng)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體，溶酶體以及細(xì)胞膜。

2.4 拉曼標(biāo)簽的表征

利用激光共聚焦拉曼光譜(inVia Renishaw, UK)對所有樣品的拉曼圖譜進(jìn)行表征。液體樣品放入0.5 mm毛細(xì)管，在拉曼光譜儀完成對焦后，拉曼采集條件為：532 nm激光，40 mW激光強(qiáng)度，10 s的曝光時(shí)間，2次累計(jì)。場發(fā)射的掃描電鏡(FESEM, Zeiss SIGMA, UK)對標(biāo)簽的形貌進(jìn)行表征。將所有樣品水溶液置于硅片上，待自然干燥后進(jìn)行噴金處理，以提高FESEM的導(dǎo)電性，10kv電壓下完成圖像的采集。

3 分析與討論

3.1 拉曼標(biāo)簽的制備及表征

采用傳統(tǒng)的乳液聚合法合成一系列的三鍵聚合物。如圖1所示，三鍵的小分子單體通過共價(jià)鍵連接聚集形成大分子的聚合物；并且調(diào)整兩種三鍵單體的比例且在同一體系中共聚，所制備出的聚合物使得兩種三鍵的拉曼強(qiáng)度可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，即通過強(qiáng)度編碼的形式制備出更多的具有三鍵拉曼信號的拉曼活性聚合物。在聚合物納米粒子上引入有靶向功能的分子即可制備出三鍵的納米拉曼標(biāo)簽用于目標(biāo)物的標(biāo)記識別。

圖1 含三鍵聚合物的納米標(biāo)簽的合成示意圖Fig.1 Schematic of polymer nanotags containing with triple bond

合成的三鍵聚合物的拉曼光譜如圖2a所示，三種分子結(jié)構(gòu)不同的三鍵單體聚合得到的拉曼活性聚合物(P1，P2，P3)在1800～2800 cm-1拉曼光譜區(qū)域內(nèi)分別有一個(gè)尖銳的拉曼散射峰，對應(yīng)于2223 cm-1、2227 cm-1和2241 cm-1。由于聚合物含有大量的三鍵且聚合物中無強(qiáng)的共軛分子結(jié)構(gòu)，因此標(biāo)簽的光譜具有高信噪比(>5)中且未觀察到其他背景的拉曼信號。聚合物P1、P2和P3的拉曼位移顯著不同，這歸因于聚合物分子結(jié)構(gòu)的供電子和吸電子效應(yīng)。雖然通過改變含三鍵的單體的分子結(jié)構(gòu)可以通過獨(dú)特的三鍵振動獲得更多新穎的拉曼活性聚合物，但這種策略必須提前準(zhǔn)備好分子結(jié)構(gòu)不同的單體，這需要很多的有機(jī)合成路線來完成，并且相應(yīng)的成本也會很大。為了打破這一瓶頸，我們提出了另一種方法，通過調(diào)節(jié)三鍵拉曼信號的比值來編碼三鍵的強(qiáng)度，可以獲得獨(dú)特的拉曼光譜，從而合成更多的拉曼活性聚合物作為拉曼標(biāo)簽。圖2b、c為所制備的三鍵聚合物的自發(fā)拉曼光譜圖，共聚合的方式并調(diào)整4-乙烯基-2-甲氧基-苯腈和4-乙烯基-苯腈兩種單體的比例，所制備的拉曼標(biāo)簽在1800～2800 cm-1光譜范圍內(nèi)有兩個(gè)峰，且每一個(gè)標(biāo)簽的兩個(gè)峰的比率可以進(jìn)行調(diào)節(jié)。綜上，可以得到15種具有獨(dú)特拉曼光譜的標(biāo)簽(P1-P15)。為了對所制備聚合物的拉曼強(qiáng)度進(jìn)行表征，將P1-P3聚合物與5‐乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)的拉曼強(qiáng)度進(jìn)行對比。如圖2d所示，P1、P2、P3濃度比EdU低100倍，但P1、P2、P3的拉曼強(qiáng)度比EdU都要高，表明所制備的拉曼活性聚合物的拉曼強(qiáng)度較好，可用于生物標(biāo)記使用。

圖2 (a)P1-P3聚合物的拉曼圖譜；(b)P4-P10聚合物的拉曼圖譜；(c)P10-P15聚合物的拉曼圖譜；(d)P1-P3與EdU的拉曼強(qiáng)度對比圖Fig.2 (a) Raman spectra of P1-P3 polymers; (b) Raman spectra of P4-P10 polymers; (c) Raman spectra of P10-P15 polymers; (d) Raman intensity of P1-P3 versus EdU

3.2 細(xì)胞器靶向的拉曼標(biāo)簽的制備及表征

每個(gè)細(xì)胞器對于機(jī)體的正常功能和生命活動都承擔(dān)著重要的角色。比如，溶酶體(Lyso)是低pH(約4.50)的細(xì)胞單層消化腔室，主要負(fù)責(zé)將生物大分子降解為低分子量物質(zhì)，而且也參與了許多關(guān)鍵的生命活動，包括細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，凋亡，膽固醇穩(wěn)態(tài)等；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)負(fù)責(zé)生產(chǎn)三維功能蛋白質(zhì)，并且調(diào)控基礎(chǔ)蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的穩(wěn)態(tài)以及合成；線粒體(Mito)是能量的供體，它主要是調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生，鈣循環(huán)等。除細(xì)胞器之外，細(xì)胞膜也是細(xì)胞中重要的組成部分，它是細(xì)胞維持穩(wěn)定代謝以及調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的最重要的通道，且膜上蛋白可以反映細(xì)胞的生理狀態(tài)。因此，針對細(xì)胞中特定細(xì)胞器和細(xì)胞膜靶向成像已經(jīng)引起了研究者們廣泛的關(guān)注，細(xì)胞成像不僅可以跟蹤它們的形態(tài)變化，可以幫助理解它們的生物作用，也可以為尋找潛在的疾病治療位點(diǎn)提供依據(jù)[13]。三鍵聚合物由于其獨(dú)特的三鍵振動的多光譜能力，可以用于標(biāo)記細(xì)胞中多重物質(zhì)的可視化研究，本文選用四種聚合物拉曼標(biāo)簽，對三種亞細(xì)胞器以及細(xì)胞膜的成像進(jìn)行研究。通過聚合物上的COOH基團(tuán)引入不同的靶向基團(tuán)，叔胺具有強(qiáng)質(zhì)子可以靶向酸性溶酶體腔內(nèi)，將其修飾于P1上用于靶向溶酶體(Lyso-P1)；三苯基膦(TPP+)是一種帶正電荷的與線粒體基質(zhì)具有高親和力的基序，將其修飾在到P2上用于靶向線粒體(Mito-P2)；苯磺酰胺修飾于P3用于靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER-P3)；由于腫瘤細(xì)胞膜富含葉酸受體蛋白，所以采用葉酸附著在P8上用于靶向于腫瘤細(xì)胞膜(CM-P8)。如圖3所示，合成的聚合物(P1, P2, P3, P8)呈現(xiàn)十分均一的球形，粒徑大約為80 nm，這與水合粒徑表征結(jié)果相吻合。由拉曼標(biāo)簽Lyso-P1、Mito-P2、ER-P3、CM-P8的FESEM圖像可知，拉曼標(biāo)簽(圖3 E-H)也是十分均一的球形，實(shí)際觀察到的粒徑與P1、P2、P3、P8結(jié)果相似，這些納米級的標(biāo)簽更容易進(jìn)入細(xì)胞。FESEM圖像難以觀察到小分子的存在，但從圖像中能夠發(fā)現(xiàn)拉曼標(biāo)簽的聚合物球相比空白的標(biāo)簽，變得不光滑，推測有其他物質(zhì)負(fù)載在聚合物表面。

圖3 (a-d)拉曼活性聚合物的FESEM圖像;(E-H)細(xì)胞器靶向拉曼標(biāo)簽的FESEM圖像。(a)P1;(b)P2;(c)P3;(d)P8;(e)Lyso-P1;(f)Mito-P2;(g)ER-P3;(h)CM-P8Fig.3 (a-d) FESEM images of Raman active polymers; (e-h) FESEM images of specific subcellular organelle probes. (a) P1; (b) P2; (c) P3; (d) P8; (e) Lyso-P1; (f) Mito-P2; (g) ER-P3; (h) CM-P8

3.3 三鍵標(biāo)簽用于細(xì)胞器成像的研究

所制備的三鍵聚合物修飾上對細(xì)胞器有靶向功能的小分子，并將所制備出的三鍵標(biāo)簽用于細(xì)胞器靶向的成像研究。如圖4所示，四種標(biāo)簽的三鍵拉曼散射信號各異。圖4a-c分別為標(biāo)簽對于活細(xì)胞溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的拉曼成像圖，在細(xì)胞中可以探測到標(biāo)簽的拉曼信號，將所檢測到的三鍵拉曼信號轉(zhuǎn)化成“顏色”來表達(dá)其分布，可以發(fā)現(xiàn)三鍵標(biāo)簽在細(xì)胞中有較好的分布，且三鍵標(biāo)簽可以標(biāo)記出不同細(xì)胞器的位置。值得關(guān)注地，圖4d代表用于細(xì)胞膜的拉曼成像圖，選用的標(biāo)簽具備三鍵的雙峰信號輸出特點(diǎn)。利用三鍵的兩種拉曼位移為拉曼“顏色”輸出，其兩者顏色的疊加可以再轉(zhuǎn)換成另外的一種顏色，其顏色裝換也就實(shí)現(xiàn)了標(biāo)簽對于目標(biāo)物的成像識別。

圖4 拉曼標(biāo)簽用于細(xì)胞的成像圖。(a)溶酶體成像圖及所用標(biāo)簽(Lyso-P1)的拉曼光譜圖；(b)線粒體成像圖及所用標(biāo)簽(Mito-P2)的拉曼光譜圖;(c)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成像圖及所用標(biāo)簽(ER-P3)的拉曼光譜圖；(d)細(xì)胞膜成像圖及所用標(biāo)簽(CM-P8)的拉曼光譜圖Fig.4 Raman imaging of subcellular organelles by Raman-active codes. (a) Raman imaging of lysosome by Lyso-P1; (b) Raman imaging of mitochondria by Mito-P2; (c) Raman imaging of ensoplasmic reticulum by ER-P3; (d) Raman imaging of cell membrane by CM-P8

4 結(jié)論

在本研究中，我們制備出了十五種拉曼信號輸出各異的多色拉曼標(biāo)簽，主要是采用兩種合成策略，其一是改變?nèi)I單體的分子結(jié)構(gòu)，其二是利用兩種不同的三鍵分子的單體進(jìn)行共聚合，并對兩種三鍵分子的拉曼散射的強(qiáng)度進(jìn)行了編碼調(diào)節(jié)。首次實(shí)現(xiàn)了三鍵分子的拉曼強(qiáng)度編碼在納米單粒子上，制備出了拉曼散射各異的拉曼標(biāo)簽，拉曼標(biāo)簽呈單分散的納米粒子，粒徑均一，且拉曼信號穩(wěn)定。選用四種拉曼標(biāo)簽分別與亞細(xì)胞器和腫瘤細(xì)胞膜靶向的小分子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞器和腫瘤細(xì)胞膜的成像。