周 潔, 王 磊, 王成海

(1. 揚州大學附屬醫(yī)院 病理科, 江蘇 揚州, 225000;2. 揚州大學醫(yī)學院 病理教研室, 江蘇 揚州, 225002)

結(jié)直腸癌(CRC)又稱大腸癌, 是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第4大原因[1]。CRC的早期篩查和診斷主要基于光纖結(jié)腸鏡檢查結(jié)果和糞便隱血檢測結(jié)果，然而結(jié)腸鏡檢查費用昂貴且具有侵入性，糞便隱血檢測則具有敏感性和器官特異性不高的缺點[2]。因此，臨床亟需探尋一種針對CRC的簡單、無創(chuàng)、診療效率高的生物標志物。轉(zhuǎn)運RNA衍生的小RNA(TDSR)是轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)的片段，其長度通常為14～50個核苷酸(nt)。TDSR失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，如癌癥、病毒感染、代謝紊亂和神經(jīng)退行性疾病[3-4]。研究[4]表明, CRC患者血漿TDSR中的5′-tRF-Gly-GCC水平高于健康對照者，可作為CRC的一種診斷生物標志物，且TDSR表達譜分析結(jié)果顯示5′tiRNA-Val-CAC表達水平升高。本研究探討5′tiRNA-Val-CAC在CRC組織和CRC細胞中的表達情況、病理意義及其對CRC細胞生長與增殖的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2021年12月在揚州大學附屬醫(yī)院接受CRC根治術(shù)并經(jīng)病理檢查確診CRC的82例患者作為研究對象，男56例，女26例，年齡44～71歲，中位年齡55歲。納入標準: ① 臨床資料、病理資料無缺失者; ② 經(jīng)病理檢查明確診斷CRC者; ③ 術(shù)前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者; ④ 對本研究知情同意者。排除標準: ① 合并其他部位惡性腫瘤者; ② 妊娠期或哺乳期女性; ③ 自身免疫性疾病、感染性疾病患者。選取82例患者的CRC組織進行檢測，同時選取各患者對應的距癌組織5 cm 處的正常結(jié)直腸組織作為對照(所有癌旁正常組織經(jīng)蘇木精-伊紅染色明確無CRC細胞)。本研究經(jīng)揚州大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核備案(2022-YKL2-21-006)。

1.2 細胞和質(zhì)粒

CRC細胞系SW620、HCT116和正常人腸上皮細胞(HIEC)均購于中科院上海細胞庫。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(HyClone 公司)，培養(yǎng)基中添加1%的青鏈霉素(Invitrogen公司)。將細胞置于37 ℃、5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5′tiRNA-Val-CAC模擬物或抑制劑相關(guān)質(zhì)粒和對照組質(zhì)粒均購自上海生工生物科技有限公司。使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司)將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CRC細胞中，分為過表達5′tiRNA-Val-CAC組(過表達組)、Scramble對照組、敲低5′tiRNA-Val-CAC組(敲低組)和正常對照組。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)實驗

使用TRIzol試劑(Invitrogen 公司)分離總RNA[260 nm處光密度與230 nm處光密度的比值(OD260 nm/OD230 nm)>1.8]。根據(jù)試劑盒說明書要求，使用Prime-Script First cDNA試劑盒(Takara公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)。按照qRT-PCR試劑盒(Takara公司)說明書在Applied Biosystems 7500 PCR儀器上進行qRT-PCR實驗。反應條件: 預變性95 ℃ 30 s, 然后95 ℃ 5 s→60 ℃ 45 s，共計40個聚合酶鏈反應(PCR)擴增循環(huán)，非編碼RNA(ncRNA)的內(nèi)參為U6，信使RNA(mRNA)的內(nèi)參為GAPDH。所得實驗數(shù)據(jù)均與內(nèi)參對比后再進行統(tǒng)計學分析。5′tiRNA-Val-CAC上游引物為ACGGAACCUUUCGCAGCG, 下游引物為ACGTGCTTCTGTAGTGTAGT。

1.4 RNA原位雜交技術(shù)(RISH)檢測5′tiRNA-Val-CAC表達

82例CRC癌組織標本進行RISH實驗，實驗步驟按照原位雜交試劑盒(武漢博士德公司)說明書進行。5′tiRNA-Val-CAC探針序列為GCTTC

TGTAGTGTAGTGGTT和TGGTTATCACGTTCGCCTC。根據(jù)每張癌組織切片5個高倍視野下5′tiRNA-Val-CAC陽性細胞計數(shù)占比情況將82例CRC患者分為高表達組與低表達組，其中低表達組的5′tiRNA-Val-CAC陽性細胞占比<5%, 高表達組的5′tiRNA-Val-CAC陽性細胞占比為5%～100%。

1.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖活性

將96孔白板橫向孔依次標注數(shù)字1→12，縱向孔依次標注英文字母A→H, 實驗接種選擇孔為橫向3→10孔、縱向B→F孔。3B→3E孔為培養(yǎng)液組, 4B→4E孔為正常癌細胞+培養(yǎng)液組(空白對照), 5B→5E孔為過表達組, 6B→6E孔為Scramble對照組(過表達組的對照細胞組); 7B→7E孔為敲低組，4B→4E孔為正常對照組(敲低組的正常細胞對照組)。

將SW620細胞懸浮于96孔板的孔洞里，每個孔洞加入100 μL[(4～5)×103個細胞]，設(shè)置3個復孔(D→E)。將細胞置入5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱里中培養(yǎng)，直至鋪滿整個孔底。每個孔中加入CCK-8溶液10 μL, 輕輕擊打培養(yǎng)板使細胞與溶液混勻，于細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標儀于450 nm處檢測光密度(OD)值，分析敲低、過表達5′tiRNA-Val-CAC對細胞增殖活性的影響。

1.6 細胞克隆平板實驗

將各組SW620細胞接種于6孔板中(10 000個/孔)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后，棄培養(yǎng)基。在4%多聚甲醛固定30 min后用0.4%結(jié)晶紫染色20～30 min, 于光學顯微鏡下觀察，對細胞克隆數(shù)目進行計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 5′tiRNA-Val-CAC在不同組織和細胞中的相對表達量

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，82例CRC組織中5′tiRNA-Val-CAC相對表達量為(3.69±0.52), 高于癌旁正常組織(設(shè)定相對表達量數(shù)值為1), 差異有統(tǒng)計學意義(t=9.111,P=0.012); CRC細胞系SW620、HCT116中5′tiRNA-Val-CAC相對表達量分別為(4.18±0.46)、(3.47±0.68), 均高于HIEC細胞(設(shè)定相對表達量數(shù)值為1)，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.475、7.158,P=0.008、0.019), 見圖1。

兩者比較, *P<0.05。圖1 5'tiRNA-Val-CAC在不同組織和細胞中的相對表達量

2.2 CRC組織與癌旁正常組織中5′tiRNA-Val-CAC陽性表達情況

RISH實驗結(jié)果顯示, CRC組織中陽性表達的5′tiRNA-Val-CAC為棕黃色顆粒，大小不一，以細胞質(zhì)染色為主, 5′tiRNA-Val-CAC在癌旁正常組織中為陰性表達或極少陽性表達，見圖2。CRC組織中5′tiRNA-Val-CAC陽性表達率為82.93%(68/82), 癌旁正常組織中5′tiRNA-Val-CAC陽性表達率為7.32%(6/82), 差異有統(tǒng)計學意義(χ2=31.444,P<0.001)。

A、B: 5'tiRNA-Val-CAC在CRC組織中陽性表達(陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒,位于細胞漿中); C: 5'tiRNA-Val-CAC在癌旁正常組織中陰性表達。圖2 RISH檢測5'tiRNA-Val-CAC在不同組織中的表達情況(光學顯微鏡,放大200倍)

2.3 5′tiRNA-Val-CAC陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系

將5′tiRNA-Val-CAC陽性細胞占比<5%的30例CRC患者納入低表達組，將5′tiRNA-Val-CAC陽性細胞占比為5%～100%的52例CRC患者納入高表達組。高表達組腫瘤直徑≥3 cm者、中低分化者占比高于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 2組其他方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見表1。由此表明, 5′tiRNA-Val-CAC高陽性表達與CRC患者腫瘤直徑和分化程度具有相關(guān)性(P<0.05), 與患者性別、年齡、發(fā)病部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期無相關(guān)性(P>0.05), 見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中5′tiRNA-Val-CAC表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 5′tiRNA-Val-CAC對CRC細胞增殖與生長的影響

過表達組72 h時的OD450 nm高于Scramble對照組，敲低組72 h時的OD450 nm低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 細胞克隆平板實驗顯示，過表達組細胞克隆數(shù)目多于Scramble對照組，敲低組細胞克隆數(shù)目少于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、表2。由此表明，過表達5′tiRNA-Val-CAC后細胞增殖活性增強、細胞克隆數(shù)目增多，而敲低5′tiRNA-Val-CAC表達后細胞增殖活性下降、細胞克隆數(shù)目減少，即5′tiRNA-Val-CAC能促進CRC細胞增殖與生長。

A、B: 各組細胞不同時點增殖活性(2組比較, *P<0.05); C: 各組細胞克隆平板實驗結(jié)果。圖3 5'tiRNA-Val-CAC對SW620細胞增殖與生長的影響

表2 各組SW620細胞增殖與生長情況比較

3 討 論

在中國, CRC是第3大常見的消化系統(tǒng)癌癥[1]。每年死于CRC的患者人數(shù)占全球死亡人數(shù)的9.2%, CRC患者5年生存率和10年生存率分別為65%和58%, 死亡原因多為CRC轉(zhuǎn)移與復發(fā)。近年來, CRC(尤其是直腸癌和遠端結(jié)腸癌)的總體發(fā)病率有所下降，但50歲以下人群的CRC發(fā)病率有所上升[5]。通過早期發(fā)現(xiàn)、切除癌前病變與腺瘤和廣泛的CRC篩查, CRC的發(fā)病率和病死率均明顯下降[6]。目前研究[7]認為, CRC的誘因包括肥胖、少膳食纖維飲食、長期炎癥性腸病以及腸道微生物群改變。

tRNA是一種經(jīng)典的ncRNA[8]，負責將mRNA上的遺傳信息翻譯為新生的蛋白質(zhì)。在激素、缺氧和應急等生理和病理條件下，tRNA可衍生出許多的片段，包括tiRNAs和tRFs, 這些tRNA衍生片段的重要功能正逐漸被發(fā)現(xiàn)，并能作為信號分子和基因表達的調(diào)控因子調(diào)節(jié)腫瘤、代謝性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的病理過程[9-10]。SHAO Y等[11]報道, tRF-Leu-CAG在非小細胞肺癌中表達水平升高，能導致G0/G1細胞周期進展，從而促進癌細胞增殖。CRC中tRF/miR-1280表達水平下調(diào)，過表達tRF/miR-1280會抑制CRC細胞的增殖和集落形成，而敲低tRF/miR-1280會促進CRC細胞的增殖和集落形成[12]。KIM H K等[13]研究結(jié)果表明，抑制3′tRNA-Leu-CAG可誘導肝癌細胞凋亡，但在體內(nèi)不能誘導正常肝細胞凋亡。ZHAO C M等[14]在透明細胞腎癌患者血清中分離了5種5′-tRNA, 且其表達水平均下調(diào)，表明其可能為腫瘤抑制因子。在乳腺癌中, tRFs可調(diào)節(jié)癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖[15]。相關(guān)研究[4]TDSR表達譜分析結(jié)果顯示CRC患者5′tiRNA-Val-CAC表達上調(diào)，故本研究進一步觀察了5′tiRNA-Val-CAC在CRC組織中的表達情況，并分析5′tiRNA-Val-CAC與CRC患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性及其對CRC細胞生長與增殖的影響。

本研究通過RISH實驗發(fā)現(xiàn), 5′tiRNA-Val-CAC在大多數(shù)CRC組織中呈陽性表達，且qRT-PCR實驗結(jié)果顯示, 5′tiRNA-Val-CAC在CRC組織和CRC細胞株中表達水平升高，提示5′tiRNA-Val-CAC在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中起著促癌基因的作用。進一步分析5′tiRNA-Val-CAC陽性表達與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn), 5′tiRNA-Val-CAC高陽性表達與腫瘤大小和分化程度密切相關(guān)，而與患者性別、年齡、發(fā)病部位、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期無相關(guān)性。由此表明，5′tiRNA-Val-CAC可能與腫瘤的增殖和分化有關(guān)，即5′tiRNA-Val-CAC在CRC中表達水平越高，腫瘤細胞分化越低，越能增殖生長，進一步說明5′tiRNA-Val-CAC屬于促癌基因，可影響CRC的進展和預后。未來進一步實驗后, 5′tiRNA-Val-CAC或可成為CRC生長的生物標志物，用于CRC的診斷和預后評估。TNM分期中的T代表原發(fā)腫瘤的大小和浸潤深度，但本研究結(jié)果顯示5′tiRNA-Val-CAC表達與CRC的TNM分期無關(guān)，這可能是因為本研究劃分的腫瘤直徑大小與TNM分期原發(fā)腫瘤大小不一致且本研究標本數(shù)量偏少。

本研究尚存在不足之處，例如僅在功能方面對5′tiRNA-Val-CAC進行相關(guān)研究，而未驗證5′tiRNA-Val-CAC的下游靶基因，也未研究5′tiRNA-Val-CAC影響CRC細胞生長與增殖的具體分子信號通路，故未來還應繼續(xù)深入探討5′tiRNA-Val-CAC對CRC細胞增殖的具體調(diào)控機制等。

綜上所述, 5′tiRNA-Val-CAC是一種新的促癌基因，在CRC組織中高表達，能促進CRC細胞的生長與增殖。今后, 5′tiRNA-Val-CAC或可成為CRC增殖的分子標志物，用于CRC的診斷和預后判斷。