顧建建

(江蘇省南通市通州區(qū)人民醫(yī)院, 江蘇 南通, 226300)

約90%以上的食管癌患者的病理結(jié)果為鱗狀細(xì)胞癌[1-2]。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致食管癌患者死亡的最主要原因。然而，在轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的早期階段，患者臨床表現(xiàn)不夠明顯，常規(guī)檢查未能發(fā)現(xiàn)[3]。目前，放射療法是食管癌的有效治療手段之一。研究[4]顯示，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)在腫瘤發(fā)展的早期即可從原發(fā)灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)或者淋巴循環(huán)而導(dǎo)致全身播散，這對(duì)惡性腫瘤的早期診斷、療效評(píng)估及疾病預(yù)后等具有重要的臨床價(jià)值[5]。本研究采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)食管鱗癌患者的CTCs，探討CTCs與食管鱗癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2019年8月11日—2021年3月4日南通市通州區(qū)人民醫(yī)院收治的114例食管鱗癌患者的臨床資料，其中男88例，女26例，年齡48～87歲，平均(64.39±8.38)歲。所有患者經(jīng)胃鏡活檢確診為食管鱗癌，且未接受過(guò)手術(shù)、放射治療、化療，卡氏功能狀態(tài)評(píng)分(KPS評(píng)分)≥70分，預(yù)期生存時(shí)間超過(guò)3個(gè)月。TNM分期根據(jù)《食管癌放射治療指南(2019版)》[6]評(píng)定，其中50例不可根治切除或不愿接受手術(shù)的局部晚期食管鱗癌患者在檢測(cè)CTCs后接受了根治性放療，并在放療結(jié)束1周內(nèi)再次行CTCs檢測(cè)，其中男35例，女15例，年齡49～87歲，平均(65.32±9.52)歲。

1.2 方法

1.2.1 CTCs檢測(cè): 采集患者外周靜脈血5 mL, 抗凝處理后室溫保存, 24 h內(nèi)行富集處理。將血液離心、棄上清、去除血紅蛋白及血紅素。在樣本中加入紅細(xì)胞裂解液，再次離心、棄上清、去除紅細(xì)胞，白細(xì)胞及稀有細(xì)胞便沉淀下來(lái)。吸取適量磁珠洗滌并加入上述樣本中，混勻，使白細(xì)胞與磁珠充分結(jié)合。再次離心、去除相結(jié)合的磁珠與白細(xì)胞。濃縮體積并去除殘留磁珠后進(jìn)行涂片。進(jìn)行免疫熒光染色，得到表面標(biāo)記CD45陰性、8號(hào)染色體著絲粒探針(CEP-8)陽(yáng)性、4′, 6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)陽(yáng)性的CTCs, 由3位工作人員獨(dú)立進(jìn)行鏡下讀片，平均數(shù)為CTCs計(jì)數(shù)(圖1)。目前尚無(wú)國(guó)際化判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究取CTCs≥3個(gè)為陽(yáng)性。

A: CD45陰性; B: CEP-8陽(yáng)性; C: DAPI陽(yáng)性; D: CTCs合成圖。箭頭所示為CTCs。圖1 熒光原位雜交技術(shù)顯示的CTCs(放大倍數(shù)400倍)

1.2.2 治療方案及療效評(píng)價(jià): 50例食管鱗癌患者均采用三維適形放療，設(shè)備為德國(guó)西門(mén)子直線加速器。放療處方劑量為1.8～2.0 Gy/次, 1次/d, 5次/周，放療25次后進(jìn)行第2次定位，并局部縮野推量，總劑量為60.0～70.0 Gy。依據(jù)患者放療前、二次定位CT及放療后3周的CT結(jié)果進(jìn)行近期療效評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《實(shí)體瘤客觀療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》[7]相關(guān)內(nèi)容，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進(jìn)展(PD)。緩解率(RR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。放療完成后3周進(jìn)行序貫化療，并于每2個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行復(fù)查，無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)定義為從放療開(kāi)始至腫瘤進(jìn)展的時(shí)間，隨訪截至2021年9月1日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，生存率采用 Kaplan-Meier方法，繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)差異的顯著性。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析以判定獨(dú)立預(yù)后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CTCs與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

114例食管鱗癌患者CTCs陽(yáng)性率與年齡、性別、腫瘤位置無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤T分期、N分期、M分期以及臨床分期有相關(guān)性(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 114例食管鱗癌患者CTCs與臨床病理特征關(guān)系

2.2 放療前后CTCs的變化

50例患者放療前的CTCs陽(yáng)性率為62.00%(31/50), 放療后的CTCs陽(yáng)性率為52.00%(26/50), 放療前后的CTCs陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.020,P=0.313)。

2.3 CTCs與食管鱗癌患者放療近期療效的關(guān)系

50例患者中, 33例患者放療后評(píng)價(jià)為緩解(CR+PR), 17例評(píng)價(jià)為SD。與CTCs陽(yáng)性患者相比 ,CTCs陰性患者放療前及放療后的RR均更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 放療前陽(yáng)性而放療后陰性患者的RR高于放療前后均為陽(yáng)性、放療前陰性而放療后陽(yáng)性、放療前后均為陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.644,P=0.009)。見(jiàn)表2。

表2 50例食管鱗癌患者CTCs與放療后近期療效的關(guān)系

2.4 CTCs與食管鱗癌患者放療后PFS的關(guān)系

截至2021年9月1日，本研究50例患者均完成隨訪，共有27例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線并進(jìn)行生存分析，放療前CTCs陰性患者PFS為18.62個(gè)月(95%CI: 15.24～21.99), 高于CTCs陽(yáng)性患者的13.84個(gè)月(95%CI: 10.01～17.68), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)。放療后CTCs陰性患者PFS為19.58個(gè)月(95%CI: 16.51～22.67), 高于CTCs陽(yáng)性患者的12.13個(gè)月(95%CI: 7.94～16.32), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。見(jiàn)圖2。

A: 放療前生存曲線; B: 放療后生存曲線。

2.5 多因素Cox回歸分析PFS的影響因素

年齡、性別、T分期、N分期、放療前CTCs與PFS無(wú)相關(guān)性(P>0.05), 腫瘤臨床分期、放療后CTCs是食管鱗癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 食管鱗癌患者放療后PFS的COX回歸分析

3 討 論

食管癌是常見(jiàn)的預(yù)后較差的惡性腫瘤，其5年生存率僅為20%左右，腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其主要原因[8]。目前，食管癌檢測(cè)的主要手段是影像學(xué)檢測(cè)及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，但是影像學(xué)檢查無(wú)法及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，而食管癌也缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物。CTCs可從腫瘤處脫落并通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)及淋巴系統(tǒng)進(jìn)行全身播散，是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)CTCs的檢測(cè)較傳統(tǒng)檢查能更及時(shí)地對(duì)腫瘤進(jìn)展進(jìn)行評(píng)估，且具有易于獲得、相對(duì)無(wú)創(chuàng)、可以反復(fù)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，具有成為“實(shí)時(shí)腫瘤活檢”的可能性。由于CTCs在外周血中含量極少, 106～108個(gè)血細(xì)胞中僅存在1個(gè)CTCs[9], 因此在CTCs檢測(cè)中富集是必要的。較為常見(jiàn)的富集技術(shù)是形態(tài)學(xué)富集法和免疫磁珠抗原依賴技術(shù)[10], 其中形態(tài)學(xué)富集法具有操作便捷、價(jià)格相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，但缺乏特異性，存在漏檢可能; 免疫磁珠抗原依賴技術(shù)分為陽(yáng)性及陰性富集法，前者通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表達(dá)的上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)進(jìn)行直接富集，后者通過(guò)去除CD45陽(yáng)性的白細(xì)胞進(jìn)行間接富集。本研究采用的陰性富集法不依賴CTCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，具有更高的檢測(cè)率，而且所檢出的CTCs具有更高的活性。

本研究發(fā)現(xiàn)CTCs與T分期、N分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有相關(guān)性，與年齡、性別、腫瘤部位無(wú)相關(guān)性。目前CTCs在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤中得到廣泛研究，但在食管癌方面的研究較少，且研究結(jié)果也存在差異。MATSUSHITA D等[11]對(duì)90例食管癌患者的研究顯示, CTCs水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有相關(guān)性，與T分期、N分期無(wú)相關(guān)性。LI SP等[12]報(bào)道食管癌CTCs水平僅與臨床分期有關(guān)。QIAO Y等[13]研究顯示, CTCs水平與T分期、N分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。造成上述研究結(jié)果差異的原因可能是各研究檢測(cè)方法有差異及研究樣本不同所致，食管癌外周血CTCs仍缺乏大樣本的研究報(bào)道，但總體上CTCs能反映食管癌的進(jìn)展程度, CTCs的檢測(cè)能對(duì)食管癌病情進(jìn)行有效評(píng)估。在I期食管癌中, CTCs陽(yáng)性率為22.22%, 證明食管癌早期即可發(fā)生腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶進(jìn)入血液循環(huán)，而此類患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此CTCs能篩選食管癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的高危人群。本研究中，非轉(zhuǎn)移食管鱗癌CTCs陽(yáng)性率為54.81%, 表明CTCs在腫瘤未發(fā)生轉(zhuǎn)移前即可被檢測(cè)到，較傳統(tǒng)影像學(xué)檢測(cè)更為靈敏。

化療能有效降低患者CTCs水平，故本研究在患者行序貫化療前行CTCs檢查，且重點(diǎn)觀察放療對(duì)CTCs水平的影響。本研究中，患者放療后CTCs陽(yáng)性率較放療前有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 考慮放療作為局部治療手段較化療無(wú)法在短期內(nèi)顯著降低CTCs水平，同時(shí)本研究樣本量較小，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。本研究顯示放療前后CTCs水平能評(píng)估患者近期RR，且CTCs放療前陽(yáng)性而放療后陰性患者RR較高，提示放療對(duì)腫瘤原發(fā)灶的有效控制可能與放療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡、促進(jìn)免疫性抗原釋放、激活機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)有關(guān)[14-15]。本研究4例患者出現(xiàn)放療前陰性而放療后陽(yáng)性的情況，且療效評(píng)估均為SD, 提示放療效果不佳時(shí)CTCs水平會(huì)進(jìn)一步提高。研究[16-18]指出CTCs與乳腺癌、肺癌、胃癌等惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CTCs放療前后水平與食管鱗癌患者預(yù)后密切相關(guān)，即CTCs水平高的患者的預(yù)后較差、PFS較低，表明CTCs也可以作為食管鱗癌的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)，與WOESTEMEIER A等[19]報(bào)道一致。本研究還顯示放療后CTCs、腫瘤臨床分期可以作為食管鱗癌放療后的獨(dú)立預(yù)后因子，因此CTCs檢測(cè)對(duì)食管鱗癌患者的臨床診治及預(yù)后評(píng)價(jià)具有較大的指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究顯示食管鱗癌患者CTCs與T分期、N分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有相關(guān)性，CTCs是食管鱗癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要前提，對(duì)評(píng)價(jià)腫瘤的進(jìn)展程度具有重要意義; CTCs水平能有效反映食管鱗癌放療患者近期RR及遠(yuǎn)期療效，是食管鱗癌預(yù)后的重要指標(biāo)。