李文鳳，王曉燕，倉(cāng)曉燕，張榮躍，單紅麗，盧文潔，王長(zhǎng)秘，尹 炯，黃應(yīng)昆

（1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開遠(yuǎn) 661699；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，昆明 650205）

0 引言

甘蔗白葉病是由16S rXI 組植原體引起的檢疫性甘蔗病害[1]。甘蔗白葉病1954年在泰國(guó)首次發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)今在印度、巴基斯坦、越南等東南亞植蔗國(guó)家普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重，給當(dāng)?shù)卦斐删薮蠼?jīng)濟(jì)損失[3-5]。2013 年Li 等[6]首次檢測(cè)確定云南保山存在甘蔗白葉病，隨后云南臨滄和普洱主產(chǎn)蔗區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)甘蔗白葉病[7-9]，其暴發(fā)流行趨勢(shì)明顯，已嚴(yán)重影響到云南蔗糖產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

甘蔗屬宿根栽培無性繁殖作物，甘蔗白葉病植原體主要由蔗種帶病傳播，在臺(tái)灣和泰國(guó)，還可通過細(xì)針葉蟬(Matsumuratettix hiroglyphicus)和條紋閉顏葉蟬(Yamatotettix flavovittatus)進(jìn)行田間自然傳播，其他葉蟬介體還沒有被證實(shí)[10-13]。植原體的傳毒媒介及其機(jī)理是防病的基礎(chǔ)，目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體的傳毒媒介及其機(jī)理尚不明確，不利于此病害的科學(xué)防控。

2019年，對(duì)甘蔗白葉病發(fā)病最嚴(yán)重的云南耿馬蔗區(qū)植原體昆蟲介體進(jìn)行調(diào)查，共采到昆蟲介體14份進(jìn)行種類鑒定。參照Hanboonsong等[11]的方法分別提取昆蟲介體DNA，使用植原體通用引物對(duì)P1/P7[14]和R16F2n/R16R2[15]進(jìn)行Nest-PCR檢測(cè)、克隆、測(cè)序，以分析明確云南耿馬蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體昆蟲介體及優(yōu)勢(shì)種群，旨在為云南甘蔗白葉病有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲介體調(diào)查采集

2019年5—6月，對(duì)甘蔗白葉病發(fā)病最嚴(yán)重的云南耿馬賀派和芒翁蔗區(qū)植原體昆蟲介體進(jìn)行調(diào)查（北緯13°29′—23°36′，東經(jīng)99°22′—99°45′，海拔1100.00～1300.00 m）。選擇感病品種‘粵糖60 號(hào)’、‘新臺(tái)糖25號(hào)’、‘盈育91-59’、‘粵糖93-159’、‘新臺(tái)糖22號(hào)’發(fā)病嚴(yán)重地塊，采用尋集法和掃網(wǎng)法重點(diǎn)調(diào)查采集葉蟬、飛虱等植原體昆蟲介體，將采集到的昆蟲介體及時(shí)移入盛有75%酒精的離心管中保存，并記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行種類鑒定。

1.2 DNA提取

參照Hanboonsong 等[11]的方法，使用動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒（生工生物公司）提取昆蟲介體DNA。

1.3 Nest-PCR檢測(cè)

采用植原體通用引物對(duì)為P1/P7[14](P1：5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’，P7：5’-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’) 和 R16F2n/R16R2[15](R16F2n：5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’，R16R2：5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1240 bp，以抽提的昆蟲介體DNA 為模版，參照張榮躍等[8]的方法對(duì)各樣品進(jìn)行Nest-PCR檢測(cè)。

1.4 測(cè)序

隨機(jī)選擇陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，使用全式金回收試劑盒回收目的片段，并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序。所得序列在GenBank 中作BLAST 檢索對(duì)比，使用DNAMAN v6.0分析核苷酸序列。

2 結(jié)果與分析

從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴(yán)重的云南耿馬蔗區(qū)采集到14 份昆蟲介體樣品，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室種類鑒定為大青葉蟬Tettigoniella viridis6 份（其中若蟲2 份）和條紋平冠沫蟬Clovia conifer8份（其中若蟲2份）（表1）。

如表1、圖1所示，14份昆蟲介體樣品中2號(hào)、3號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)共6份樣品為陽(yáng)性，其余8份樣品為陰性。其中，10號(hào)樣品（大青葉蟬若蟲）巢式PCR擴(kuò)增條帶粗且明亮樣品中有高含量甘蔗白葉病植原體為強(qiáng)陽(yáng)性，3號(hào)、9號(hào)樣品（大青葉蟬若蟲、成蟲）和2號(hào)、5號(hào)、8號(hào)樣品（條紋平冠沫蟬若蟲、成蟲）巢式PCR擴(kuò)增條帶細(xì)且弱暗樣品中有低含量甘蔗白葉病植原體為弱陽(yáng)性。

圖1 14份昆蟲介體樣品甘蔗白葉病巢式PCR檢測(cè)電泳圖

表1 14份昆蟲介體樣品甘蔗白葉病巢式PCR檢測(cè)結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，2 號(hào)和10 號(hào)樣品2 個(gè)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析結(jié)果表明，本研究獲得的2條序列（Genbank 登錄號(hào)MT649297 和MT649298）與云南臨滄和斯里蘭卡甘蔗白葉病植原體分離物16S rRNA基因序列（Genbank 登錄號(hào)KR020691 和MN174860）的核苷酸序列一致性為100%。

3 結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)目前已報(bào)道的與植原體相關(guān)的病害有100余種[16]，甘蔗白葉病是近年云南蔗區(qū)快速蔓延開來的植原體新病害，現(xiàn)已嚴(yán)重影響到云南甘蔗產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效和蔗農(nóng)增收。自然條件下，葉蟬、飛虱、木虱、蚜蟲、粉虱以及椿類等是植原體的傳毒媒介[17-18]。在中國(guó)臺(tái)灣和泰國(guó)，細(xì)針葉蟬(Matsumuratettix hiroglyphicus)和條紋閉顏葉蟬(Yamatotettix flavovittatus)自然傳播甘蔗白葉病植原體，其他葉蟬介體尚未得到證實(shí)[11-14]。研究表明噴施殺蟲劑對(duì)降低SCWL 的發(fā)生率效果不理想[19-21]，甘蔗種莖用熱水處理不能有效清除種莖中的SCWL植原體[22]。而通過組織培養(yǎng)繁育健康甘蔗苗被認(rèn)為是消除甘蔗體內(nèi)SCWL植原體最有效的方法，大量推廣使用甘蔗無病組培苗及其種莖控制SCWL 在泰國(guó)收到很好的效果[23]。目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體傳毒媒介及其機(jī)理不明，不利于此病害的科學(xué)防控。本研究結(jié)果顯示，從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴(yán)重的云南耿馬蔗區(qū)采集到的大青葉蟬(T.viridis)和條紋平冠沫蟬(C.conifer)2 種昆蟲介體均被檢測(cè)為陽(yáng)性，是甘蔗白葉病植原體的自然攜帶者，說明2 種葉蟬可能為甘蔗白葉病植原體潛在昆蟲介體，而10號(hào)樣品大青葉蟬若蟲巢式PCR 擴(kuò)增條帶粗且明亮樣品中有高含量甘蔗白葉病植原體呈強(qiáng)陽(yáng)性，初步確定為優(yōu)勢(shì)種群，有待對(duì)其進(jìn)一步作獲毒、持毒及傳毒期和傳毒方式、傳毒效率等傳毒特性測(cè)試驗(yàn)證。本次調(diào)查，從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴(yán)重的云南耿馬蔗區(qū)僅采到昆蟲介體14份樣品，種類單一、數(shù)量極低，這可能與多年來國(guó)內(nèi)蔗區(qū)推廣應(yīng)用吡蟲啉、噻蟲嗪及其復(fù)配制劑有效防控甘蔗綿蚜、葉蟬、薊馬等蟲媒介體有關(guān)[24-25]，這在一定程度上也減緩了甘蔗白葉病植原體的田間自然傳播。研究結(jié)果豐富了甘蔗植原體病害相關(guān)理論和技術(shù)基礎(chǔ)，有助于制定適用于甘蔗白葉病的綜合防控措施。本研究?jī)H對(duì)云南耿馬局部蔗區(qū)和5—6月甘蔗生長(zhǎng)早期進(jìn)行調(diào)查，存在調(diào)查范圍和時(shí)期及重復(fù)性不足，應(yīng)擴(kuò)大調(diào)查范圍、延長(zhǎng)調(diào)查時(shí)期、增加調(diào)查次數(shù)，并對(duì)蟲媒介體優(yōu)勢(shì)種群進(jìn)行

獲毒、持毒及傳毒期和傳毒方式、傳毒效率等系統(tǒng)性傳毒特性測(cè)試，以期全面明確中國(guó)甘蔗白葉病植原體蟲媒介體及傳毒特性，揭示國(guó)內(nèi)甘蔗白葉病主要發(fā)生區(qū)蟲媒介體對(duì)病害發(fā)生流行的影響。

甘蔗白葉病是可造成甘蔗絕產(chǎn)絕收的一種植原體病害[1]。目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體傳播方式主要是帶毒蔗種[26]，主栽品種種莖的SCWL 陽(yáng)性檢出率均在90%以上[27]，在田間還存在大青葉蟬和條紋平冠沫蟬自然傳播，準(zhǔn)確選擇無病健康蔗株作種苗和有效防控蟲媒介體尤為重要。建立甘蔗無病健康種苗繁育基地，加強(qiáng)甘蔗白葉病監(jiān)測(cè)，及時(shí)銷毀病株，病田避免宿根連作；同時(shí)，從切斷植原體自然傳播途徑入手，及時(shí)殺滅蔗園中的葉蟬等昆蟲傳播介體。