石 柳，劉 雪，黃 喆，曾德清 (.贛州市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 贛州 34000；.全南縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 贛州 34800)

肝癌具有高侵襲轉(zhuǎn)移能力、發(fā)病隱匿、潛伏期長(zhǎng)、高增殖活性、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，早期難以準(zhǔn)確診斷，部分患者確診時(shí)病情已達(dá)中晚期，術(shù)后5年生存率較低[1-2]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的興起，分子靶向藥物逐漸被被應(yīng)用于肝癌治療，獲得可喜的成效。人類異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)蛋白基因(ASPM)與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切，在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，但ASPM在肝癌中作用研究較少[3-4]。本研究分析ASPM對(duì)肝癌細(xì)胞惡性表型的影響，為臨床對(duì)肝癌診斷和治療提供新的理論依據(jù)及靶向策略。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞系與主要試劑、儀器:人肝癌細(xì)胞株 QGY-7703購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞中心；民海生物醫(yī)學(xué)有限公司的小牛血清；Gibco公司胰蛋白酶、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；PCR儀 (Sony，Japan)；美國(guó)BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀；三箭生物技術(shù)有限公司的流式凋亡細(xì)胞檢測(cè)試劑盒；上海邦景實(shí)業(yè)有限公司的MitoTrackerTMGreen試劑盒；Transwell小室(Costar美國(guó))。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):將人肝癌細(xì)胞株 QGY-7703培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(含小牛血清10%、鏈霉素100 μg/ml、青霉素100 IU/ml)，放置在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 2～3天傳代1次，用0.02%EDTA配制的0.1%胰酶消化細(xì)胞。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 d取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h及72 h收集細(xì)胞用qRT-PCR檢測(cè)目的基因的沉默效率。以ASPM基因沉默的QGY-7703細(xì)胞為試驗(yàn)組，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的QGY-7703細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.3檢測(cè)QGY-7703細(xì)胞CCK-8生存率:siRNA沉默目的基因后，于第24 h、48 h、72 h分別檢測(cè)在波長(zhǎng)450 nm處細(xì)胞的OD值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn):siRNA沉默目的基因后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后，加入甲醇進(jìn)行固定，棄去甲醇，加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色。

1.2.5檢測(cè)細(xì)胞周期:將試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞用D-Hank′s 液漂洗，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.2.6檢測(cè)細(xì)胞的凋亡數(shù)量：siRNA沉默目的基因后，采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和MitoTrackerTMGreen試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡數(shù)量。

1.2.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移：siRNA沉默目的基因后，分別接種于Transwell小室的上室中，上室加入無(wú)血清培基，14 h后取出上室，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，流水緩慢沖洗，進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)。觀察指標(biāo)：比較兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速度、克隆形成能力、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡比例、細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速度和克隆形成能力對(duì)比:與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組QGY-7703肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。試驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成數(shù)目為(165.12±10.45)個(gè)低于對(duì)照組(264.21±12.59)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05圖1 兩組QGY-7703肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度

2.2兩組細(xì)胞周期分布對(duì)比:試驗(yàn)組G1/G0期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，S期細(xì)胞比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組G2/M期細(xì)胞比例相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞周期分布對(duì)比

2.3兩組細(xì)胞凋亡比例對(duì)比:沉默ASPM可促進(jìn)QGY-7703肝癌細(xì)胞的凋亡，試驗(yàn)組QGY-7703的凋亡水平(8.10±0.16)%高于對(duì)照組的(0.65±0.11)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4兩組細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目對(duì)比:試驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目對(duì)比個(gè)，n=3)

3 討論

肝癌屬于消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率較高，且5年存活率低下，預(yù)后欠佳[5]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)是肝癌復(fù)發(fā)與預(yù)后不佳的主要因素[6]，針對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移一直是臨床研究的熱點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞能夠無(wú)限增殖、自我更新，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤，同時(shí)其生長(zhǎng)周期較慢，可逃避化療、放療藥物作用。而目前臨床治療靶細(xì)胞為快速?gòu)?fù)制的細(xì)胞，對(duì)于此類生長(zhǎng)周期較慢的細(xì)胞靶向攻擊能力欠佳，治療期間此類細(xì)胞易潛伏，成為日后患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[7-8]。

ASPM屬于人類同源蛋白，分布于細(xì)胞有絲分裂期的紡錘體兩極和細(xì)胞周期間期的中心體，參與調(diào)控紡錘體生成和細(xì)胞周期中心體，促使細(xì)胞增殖，并可調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)分裂和有絲分裂方向，是一項(xiàng)干細(xì)胞標(biāo)志物[9]。ASPM在癌細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)隨著細(xì)胞分化程度增高而下調(diào)，降低ASPM表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的增殖能力與自我更新。本研究提示沉默ASPM基因可抑制QGY-7703的增殖能力和克隆形成能力、遷移能力，促使G1期細(xì)胞增加及S期細(xì)胞減少，加速Q(mào)GY-7703凋亡。當(dāng)ASPM發(fā)生突變，會(huì)影響其編碼的蛋白功能，造成中間體功能發(fā)生缺陷，影響染色體分離，出現(xiàn)異倍體，誘發(fā)腫瘤，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等因素密切相關(guān)。