宋新娜，梅鳳珍，李香風(fēng)，朱英波，史鳳玉,2*，劉建斌

(1.河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，昌黎 066004；2.河北科技師范學(xué)院河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實驗室，昌黎 066004；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，北京 100097；4.河北省邯鄲市園林局，邯鄲 056000）

草莓枯萎病是由尖孢鐮刀菌草莓?；虵usariumoxysoporumf.sp.fragariae引起的一種土傳真菌病害[1]，感病植株表現(xiàn)為全株枯黃萎蔫，最終枯死，在草莓的整個生育期內(nèi)均可發(fā)生，給莓農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上防控草莓枯萎病多用化學(xué)殺菌劑，如百菌清、代森錳鋅、甲基托布津和多菌靈等?；瘜W(xué)殺菌劑防效雖好，但同時帶來了食品安全、生態(tài)環(huán)境等問題，并且出現(xiàn)土壤微生態(tài)失衡、鹽漬化和酸化等一系列嚴(yán)重問題。因此，化學(xué)防治方法越來越難以滿足草莓產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的需求，尋找有效控制草莓枯萎病發(fā)生的措施刻不容緩。

生物防治對人畜安全、環(huán)境友好且不易引發(fā)抗藥性[2,3]，尤其芽胞桿菌Bacillussp.能夠產(chǎn)生多種抑菌蛋白和脂肽類抗生素[4]，這些物質(zhì)能夠抑制病原真菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成[5]、造成細(xì)胞壁破裂[6]，同時能促進(jìn)作物生長和誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性[7,8]，利用芽胞桿菌防治植物病害已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最常用的生物防治技術(shù)之一[9-14]。已有研究表明，解淀粉芽胞桿菌可用于多種植物病害防治，如番茄根腐病[15]、煙草黑脛病[16]、辣椒灰霉病[17]和馬鈴薯黃萎病[18]等，并有一定的促生[19]和提高抗逆性作用[20]。喬欣蕾等[21]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌對尖孢鐮刀菌呈現(xiàn)顯著的拮抗活性，而且對番茄灰霉病[22]、黃瓜白粉病[23]、巴西蕉枯萎病[24]等多種病原真菌、細(xì)菌表現(xiàn)出很好的抑菌活性，同時可促進(jìn)番茄和辣椒植株生長，增強(qiáng)植物體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性[25]。利用生防芽胞桿菌或其代謝產(chǎn)物抑制病原菌，符合草莓綠色健康種植及消費(fèi)者對食品安全的要求，為植物病害防治提供了新的研究方向。但由于單一生防菌在實際應(yīng)用及生產(chǎn)中適應(yīng)環(huán)境能力相對較弱，拮抗和促生作用結(jié)合較難，導(dǎo)致防治效果不甚理想，而通過生防菌優(yōu)勢互補(bǔ)有可能解決這些問題[26]。

本試驗旨在以草莓枯萎病為靶標(biāo)，從實驗室已保存的細(xì)菌中篩選出生防菌，并對生防菌的相容性和防治效果進(jìn)行評價，以期為草莓枯萎病的生防菌劑開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種 草莓品種為“紅顏”，由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所提供。

1.1.2 供試病原菌 尖孢鐮刀菌[27]由本實驗室分離并長期保存。

1.1.3 供試拮抗菌 從土壤中分離獲得且對草莓根部病害[27]和葡萄灰霉病[28]有一定拮抗效果的 15株細(xì)菌，以上菌株皆由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所保存并提供。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g，去離子水定容至1000 mL，用于細(xì)菌的平板培養(yǎng)。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：不加瓊脂，其他與牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基成分相同，用于細(xì)菌液體培養(yǎng)。馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，去離子水定容至1000 mL，用于尖孢鐮刀菌的平板培養(yǎng)和初篩試驗。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：不加瓊脂，其他與馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基成分相同，用于尖孢鐮刀菌液體培養(yǎng)。

1.2 拮抗菌株篩選

1.2.1 菌株生物量 15株細(xì)菌活化后，分別以1%接種量接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，于培養(yǎng)6、12、24、36、48、72 h時，取樣并稀釋涂布平板檢測其生物量，每個菌株3個重復(fù)。

1.2.2 初篩 在90 mm的馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基平板中央，接入直徑6 mm的尖孢鐮刀菌菌餅，同時于菌餅兩側(cè)分別接入1 μL供試細(xì)菌（7×108cfu/mL），以不接細(xì)菌的培養(yǎng)基作為對照。待對照菌落長滿平板時進(jìn)行測量，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.3 復(fù)篩 從溫室采集草莓根際土壤，稱取150 g放入250 mL三角瓶中，121 ℃、20 min滅菌后，接入尖孢鐮刀菌發(fā)酵液1 mL（1×106cfu/mL），同時接入各供試菌株發(fā)酵液（108cfu/mL）3 mL，攪拌均勻后放入光照培養(yǎng)箱中模擬溫室日夜變化培養(yǎng)（28 ℃、70%光照12 h；20 ℃、黑暗培養(yǎng)12 h）。于培養(yǎng)第5、15和35 d時，取樣并稀釋涂布記錄尖孢鐮刀菌的生物量。設(shè)置清水為對照，每個處理3個重復(fù)。

1.3 菌株相容性試驗

參考Barbosa等[29]的測定方法，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基一側(cè)接入供試菌株SA-1，同時在另一側(cè)接種菌株SV-2，其中SA-1和SV-2為1.2所得目標(biāo)拮抗菌，試驗重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)24 h。兩菌株之間若產(chǎn)生明顯的抑菌帶即為不相容，無明顯抑菌帶即為相容。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 挑取活化好的SA-1和SV-2單菌落在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出觀察其菌落的顏色、形態(tài)和大小，并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4.2 Biolog微生物自動分析鑒定 挑取活化好的SA-1和SV-2單菌落在BUG培養(yǎng)基中“米”字劃線培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽輕擦下菌苔于GN/GP-IF接種液中，制成菌懸液，用濁度計調(diào)整至濁度為（95±3）%，再用8孔移液器將菌懸液分加在GNⅢ鑒定板的各孔中。每孔各100 μL，共96孔。蓋上鑒定板蓋，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16～24 h時讀數(shù)[30]，自動檢索數(shù)據(jù)庫，比較鑒定結(jié)果。

1.4.3 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用上海生工細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株SA-1和菌株SV-2的 DNA，PCR 擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。反應(yīng)總體系為 25 μL：TaqMIX 12.5 μL，引物 27F 和 1492R 各 1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；93 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸90 s；4 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由北京諾賽生物技術(shù)有限公司測序，將測得的菌株SA-1和SV-2序列在NCBI官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，進(jìn)化距離的計算采用鄰接法，進(jìn)化樹分支模式的穩(wěn)定性用MEGA7.0軟件分析，采用bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 盆栽促生及防效試驗

將健康的、長勢一致的草莓幼苗移栽于花盆中（口徑12 cm，0.5加侖），盆中加入500 g無菌土（121 ℃高壓滅菌20 min），每盆移栽1株草莓苗。試驗共設(shè)8個處理（表1），每個處理3株，重復(fù)3次。草莓移栽后第10 d和第20 d分別進(jìn)行生防菌（7×108cfu/mL）灌根7 mL，移栽13 d后通過灌根方式接入尖孢鐮刀菌（1×106孢子/mL）2.5 mL，移栽40 d后調(diào)查病情指數(shù)并計算防治效果，同時統(tǒng)計株高、葉片數(shù)、最大葉葉面積、葉綠素、丙二醛（MDA）活性、過氧化氫酶（CAT）活性。草莓枯萎病的病情分級標(biāo)準(zhǔn)以葉片為單位，分為5級[31]：0級，無癥狀；1級，病株有1/4以下的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；2級，有1/4～1/2的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；3級，有1/2以上的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；4級，病株死亡或接近死亡。病情指數(shù)＝∑（各級病葉數(shù)×代表數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級值）×100，防治效果（%）＝∑（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。最大葉葉面積＝最大葉葉長×最大葉葉寬×0.98[32]；葉綠素測量采用SPAD502plus葉綠素儀；并采用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定草莓葉片中丙二醛（MDA）和過氧化氫酶（CAT）活性。

表1 田間試驗設(shè)計Table 1 Field experiment design

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 24（One-way ANOVA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株篩選

2.1.1 菌株生物量分析 從表2可以看出，供試15株細(xì)菌，培養(yǎng)時間不同，菌株生物量呈現(xiàn)明顯差異。培養(yǎng)6 h菌株S5、S4、S14、S15、和S7生長較快，且依次減弱；培養(yǎng)12 h菌株S5、S4、S15、SA-1和SV-2生長較快，且依次減弱；培養(yǎng)24 h菌株S5、S4、S15、S12、S14、SA-1、S3、S7和SV-2生長較快，且依次減弱；培養(yǎng)36 h菌株S5、S4、SA-1、S15和SV-2生長較快，且依次減弱；培養(yǎng)48 h菌株S5、S4、SA-1、S3、SV-2和S14生長較快，且依次減弱；培養(yǎng)72 h菌株S5、S4、SA-1、S3、S13、S15和SV-2生長較快，且依次減弱。綜上，S5、S4、SA-1、S3、S15和SV-2生長較快。

表2 不同菌株72 h內(nèi)生物量變化Table 2 Biomass changes of different strains within 72 h

2.1.2 初篩 從表3和圖1可以看出，菌株SV-2和SA-1對草莓枯萎病原菌的抑制效果較好，抑制率分別為66.67%和64.39%，與其他菌株間存在顯著性差異。其次是菌株S2、S3、S1，抑制率為59.19%、57.47%和54.60%。其他菌株對草莓枯萎病原菌的抑制效果相對較低，抑制率不足50%。因此，菌株SV-2、SA-1、S2、S3、S1對草莓枯萎病菌有抑制作用。

圖1 菌株SA-1和SV-2對草莓枯萎病原菌的抑菌效果Fig.1 The effect of strain SA-1 and SV-2 on F.oxysporium

表3 拮抗菌對尖孢鐮刀菌的抑菌效果Table 3 Effect of antagonistic bacterium on F.oxysporum

2.1.3 復(fù)篩 從表4可以看出，不同菌株處理土壤后，土壤中病原菌數(shù)量存在明顯差異。處理第5 d時，菌株S7、SV-2、SA-1、S2、S4、S3、S9和S13表現(xiàn)出抑制效果較好，且依次減弱，處理間差異不顯著，但與空白對照間存在顯著差異。處理第15 d時，菌株S2、S7、SV-2、S1、SA-1、S3、S4、S12表現(xiàn)出較好抑制效果，且依次減弱，處理間差異不顯著，但與空白對照間存在顯著差異。第35 d時，菌株SV-2和SA-1處理土壤中病原菌數(shù)量表現(xiàn)為較低，與空白對照存在顯著差異。綜上表明，菌株SV-2和SA-1對尖孢鐮刀菌抑制效果最好。

表4 拮抗菌對土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響Table 4 Effects of antagonistic bacterium on total F.oxysporum population in soil

2.2 菌株SA-1和SV-2相容性

如圖2所示，菌株SA-1和SV-2間未產(chǎn)生明顯抑菌帶，表明兩菌株無拮抗作用，相容性良好。

圖2 SA-1和SV-2相容性Fig.2 Compatibility of SA-1 and SV-2

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株SA-1菌落呈白色，表面粗糙不透明，常形成褶皺，伴有多處隆起。單個細(xì)胞（0.7～0.8）μm×（2～3）μm，著色均勻，鞭毛周生，能運(yùn)動，無隔膜，革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽胞，芽胞（0.6～0.9）μm×（1.0～1.5）μm 位于菌體中央或稍偏，芽胞形成后菌體不膨大，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株SV-2菌落呈淡黃色，表面粗糙不透明、邊緣不規(guī)則，產(chǎn)芽胞，芽胞兩端鈍圓、長短不一，革蘭氏陽性，初步確定為芽胞桿菌屬。

2.3.2 Biolog鑒定 菌株培養(yǎng)22 h時讀數(shù)可知，SA-1的 Biolog系統(tǒng)顯示SIM為0.598，大于0.5，PROB為0.916，DIST為5.055，被初定為枯草芽胞桿菌（圖3A），SV-2的 Biolog系統(tǒng)顯示SIM為0.603，大于0.5，PROB為0.603，DIST為5.728，被初定為解淀粉芽胞桿菌（圖3B）。

圖3 菌株SA-1（A）和SV-2（B）的微平板圖譜Fig.3 Microplate of strain SA-1 (A) and SV-2 (B)

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 以菌株SA-1和SV-2的基因組DNA為模板，細(xì)菌通用引物27F/1492R對其16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1400 bp左右的單一特異性片段。將所測序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast序列檢索。選取比對結(jié)果較靠前部分的同源序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4。SA-1與Bacillussubtilisstrain N-11（MW345828.1）的16S rDNA序列處于同一分支。菌株SV-2與Bacillusamyloliquefaciensstrain W9（MH188056.1）的16S rDNA序列處于同一分支。該結(jié)果與Biolog的鑒定結(jié)果相吻合。

圖4 菌株SA-1和SV-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees of strain SA-1 and SV-2

2.4 拮抗菌對草莓枯萎病的盆栽防效

由圖5所示，生長40 d后，病原菌處理（T5）的草莓植株表現(xiàn)為矮小，莖基部萎蔫，葉片萎蔫，地上部逐漸干枯，出現(xiàn)明顯的枯萎病發(fā)病癥狀，草莓病情指數(shù)為49.56（表5）。單一拮抗菌處理后草莓植株長勢與清水對照相近，SA-1、SV-2處理（T6、T7）后草莓病情指數(shù)分別為21.18和19.94，防效分別為57.27%和59.77%，而復(fù)合拮抗菌處理（T8）后草莓植株長勢最好，草莓病情指數(shù)和防效分別14.21和71.33%。顯著性分析表明，單一拮抗菌處理、復(fù)合拮抗菌處理與病原菌處理間草莓病情指數(shù)和防治效果均存在顯著差異（P＜0.05）。

2.5 拮抗菌對草莓的促生作用

由圖5所示，在盆栽促生試驗中，拮抗菌處理組草莓長勢旺盛（T2、T3和T4），與清水對照（T1）處理相比，SA-1、SV-2、復(fù)合拮抗菌處理后（T2、T3和T4）草莓株高、葉綠素、最大葉葉面積均增加（表5），最大葉葉面積增加幅度較大，SA-1、SV-2、復(fù)合拮抗菌（T2、T3和T4）分別增加1.94、1.93、2.89倍。單一拮抗菌處理后葉片數(shù)有所減少，但復(fù)合拮抗菌處理后葉片數(shù)增加。

圖5 病原菌和拮抗菌處理草莓長勢對比Fig.5 Growth comparison of strawberry treated by pathogen and antagonistic bacterium

2.6 拮抗菌對草莓葉片中MDA含量和CAT活性的影響

由表5可知，與清水對照（T1）處理相比，病原菌處理（T5）后草莓葉片MDA含量明顯增加（P＜0.05），MDA含量提高1.41倍，差異顯著。其他處理（除T5）的MDA含量與清水對照（T1）處理間無明顯差異。病原菌處理（T5）后草莓葉片CAT活性，與清水對照（T1）處理相比，明顯減少，降低了1.91倍，差異達(dá)到顯著水平。拮抗菌處理（T2、T3和T4）后草莓葉片CAT含量略有增加，與清水對照（T1）處理間差異不顯著。而拮抗菌與病原菌聯(lián)合處理（T6、T7和T8）后草莓葉片CAT活性，與病原菌處理（T5）明顯增加，其中T6和T8處理差異達(dá)到顯著水平，尤其復(fù)合拮抗菌處理（T8）較之單一菌液處理（T6和T7）效果更好。

表5 拮抗菌對草莓生長和枯萎病的影響Table 5 Effects of antagonistic bacterium on plant growth and Fusarium wilt of strawberry

3 討論

芽胞桿菌屬細(xì)菌能夠產(chǎn)生耐熱且抗逆性的芽胞，分布廣泛，是植物根際和土壤微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢種群，并且抑菌譜廣，同時能促進(jìn)作物生長和誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性[8,9]。近年來，芽胞桿菌屬被認(rèn)為是最成功的一類生防菌，尤其是枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌，已有研究表明其具有拮抗多種枯萎病病原菌的能力，如枯草芽胞桿菌能夠防治香蕉[33]、黃瓜[34]、向日葵[35]和馬鈴薯[36]等枯萎病，解淀粉芽胞桿菌能夠防治番茄[37]、西瓜[38]、香蕉[39]、苦瓜[40]和棉花[41]等枯萎病，均取得較好的防治效果。然而目前對于生防芽胞菌株的應(yīng)用研究主要集中單一菌株，對2株或更多株芽胞桿菌混用效果的研究相對較少，在一定程度上影響了此類生防細(xì)菌的應(yīng)用。

本試驗以篩選草莓枯萎病的高效生防菌株為出發(fā)點(diǎn)，篩選出2株對草莓枯萎病有較強(qiáng)抑制效果的芽胞桿菌菌株SA-1和SV-2，并且這兩株菌相容性良好，通過平板對峙法進(jìn)行初篩時，2株菌的抑制率分別為64.37%和66.67%。復(fù)篩試驗第5 d能將土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量從5.95×106cfu/g分別降到2.25×106cfu/g和2.1×106cfu/g，第35 d分別降為3.5×105cfu/g和3×105cfu/g。根據(jù)形態(tài)觀察、Biolog和分子鑒定，將菌株SA-1和SV-2分別鑒定為枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis和解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens。盆栽試驗進(jìn)一步表明菌株SA-1和SV-2聯(lián)合發(fā)酵液防治效果比單一菌株更佳，防效達(dá)70%以上。這一結(jié)果表明生防菌混用在草莓枯萎病防治上具有一定的應(yīng)用潛力。

過氧化氫酶活性可作為細(xì)菌是否成為潛在生物防治劑的重要特征，因為過氧化氫酶能夠分解代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，減少植物的氧化損傷，從而增強(qiáng)植物抗病能力。而丙二醛能夠反應(yīng)植物衰老和逆境中受傷程度，從而判斷植株抗逆性高低。本試驗分析了盆栽促生及防效試驗草莓葉片中過氧化氫酶以及丙二醛活性變化，發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌處理后草莓葉片中過氧化氫酶活性增強(qiáng)，丙二醛含量下降，而且2株生防細(xì)菌混合使用較之單一菌液處理的草莓葉片過氧化氫酶活性更強(qiáng)，丙二醛含量更低。這一結(jié)果表明草莓植株內(nèi)過氧化氫酶和丙二醛含量變化可能是生防細(xì)菌混用效果提高的機(jī)制之一，SA-1與SV-2聯(lián)合使用抑制草莓枯萎病的生防機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。