李志遠(yuǎn)，趙 丹，韓勝男，韓 超，劉愛新

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271018）

溶桿菌Lysobacter屬于黃單胞菌科 Xanthomonadaceae，其中的許多種如產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenesOH11、辣椒溶桿菌L.capsiciNF87-2等能分泌多種胞外酶、抗菌物質(zhì)等，對絲狀真菌、卵菌、植物病原細(xì)菌等有不同的抑菌活性，是一類重要的植物病害生物防治資源[1-3]。辣椒溶桿菌L.capsiciX2-3是本實驗室從小麥根際分離得到的一株生防菌，對禾谷鐮孢菌Fusariumgraminearum、小麥紋枯病菌Rhizoctoniacerealis、煙草黑脛病菌Phytophthoranicotianae、白地霉Geotrichumcandidum和麥根腐平臍蠕孢菌Bipolarissorokiniana等病原菌具有較好的抑菌活性[4]，具有廣闊的應(yīng)用前景。

GntR（gluconate operon transcriptional repressor）是原核生物中分布最廣泛的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與包括運動性、發(fā)育、病原細(xì)菌的致病力等生物學(xué)過程[5,6]。GntR轉(zhuǎn)錄因子包含兩個重要的功能域，分別是與DNA結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域和與效應(yīng)物結(jié)合的C端結(jié)構(gòu)域。根據(jù)C-末端氨基酸殘基的序列差異，GntR分為7個亞家族，即FadR、HutC、MocR、YtrA、DevA、PlmA和AraR，各亞家族在細(xì)菌代謝過程中有不同的調(diào)控作用[7]。

HutC屬于GntR第二大亞家族，約占GntR數(shù)量的30%，該亞家族成員的C端結(jié)構(gòu)域由170個氨基酸組成，包括α螺旋和β折疊。第一個HutC亞家族的轉(zhuǎn)錄因子是在惡臭假單胞菌Pseudomonasputida中發(fā)現(xiàn)的，是一個組氨酸利用操縱子阻遏物[8]。此后在革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)參與多種調(diào)控作用，如在蘇云金芽孢桿菌BacillusthuringiensisBti75中，HutC主要調(diào)控N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）分解代謝[9]，在熒光假單胞菌P.fluorescensSBW25中，HutC不僅調(diào)控組氨酸代謝，而且參與細(xì)胞運動和鐵載體的產(chǎn)生[10]，在紅霉素產(chǎn)生菌Saccharopolysporaerythraea中HutC則調(diào)控紅霉素產(chǎn)量、色素合成以及氣生菌絲產(chǎn)生等[11]。作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，HutC在PGPR（plant growth-promoting rhizobacteria）細(xì)菌中的作用報道較少，尤其在溶桿菌中，目前尚沒有關(guān)于HutC在該屬細(xì)菌中調(diào)控作用的詳細(xì)報道。本研究利用同源重組技術(shù)獲得辣椒溶桿菌X2-3的LC_HutC敲除突變體MT4090，并對突變體的功能進(jìn)行了分析，研究結(jié)果為深入了解辣椒溶桿菌的定殖、趨向性、抑菌作用等及HutC對辣椒溶桿菌的調(diào)控作用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基

本試驗所用菌株、質(zhì)粒見表1。表中病原真菌和卵菌用于抑菌活性測定。

表1 本試驗所用菌株、質(zhì)粒Table 1 Strains、plasmids used in this study

所用培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基用于辣椒溶桿菌生長、生物膜產(chǎn)量分析；PDA培養(yǎng)基用于對真菌和卵菌抑菌活性分析；SWA培養(yǎng)基用于運動能力分析；培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[12]。

1.2 基因分析、引物設(shè)計

根據(jù)前期X2-3（GenBank登錄號：No.LBMI00000000.1）全基因組測序結(jié)果，查詢得到一個預(yù)測為HutC的基因，基因編號為LC4090。對該基因進(jìn)行BLAST比對并與已知功能的HutC結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ?，分析該基因的功能結(jié)構(gòu)域及與已知HutC的相似性。

根據(jù)目的基因序列設(shè)計上下游同源臂引物和目的基因引物。本研究所有引物均用Primer Premier6.0軟件設(shè)計，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表2）。

表2 本試驗中所使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.3 DNA的提取、連接、轉(zhuǎn)化及感受態(tài)的制備

DNA的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化及感受態(tài)的制備等操作參考文獻(xiàn)[13]。

1.4 敲除載體構(gòu)建和敲除突變體鑒定

本研究我們采用nptII（卡那霉素抗性基因）取代LC_HutC的方法構(gòu)建HutC缺失突變體。首先，以辣椒溶桿菌X2-3基因組DNA為模板，HutC-AF/HutC-AR、HutC-BF/HutC-BR為引物分別擴(kuò)增LC_HutC上下游同源臂A和B，再經(jīng)overlap PCR擴(kuò)增、獲得連接的片段AB。將片段AB連接pMD19-T-Simple，經(jīng)菌落PCR驗證以及測序鑒定，獲得中間質(zhì)粒pMD19-AB。質(zhì)粒pMD19-AB用SacⅠ酶切，并與從pBSL15中、用SacⅠ酶切的nptII基因片段連接，得到插入的重組質(zhì)粒pMD19-A-nptII-B；用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ從重組質(zhì)粒中將-A-nptII-B-切下，連接到自殺載體 pBR325，經(jīng)酶切驗證獲得質(zhì)粒 pBR325-AnptIIB。將質(zhì)粒 pBR325-AnptIIB電轉(zhuǎn)入 X2-3感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素（750 μg/mL）NA平板篩選、菌落 PCR驗證（HutC-AF/HutC-BR）和序列測定，獲得敲除突變體。

1.5 互補載體構(gòu)建和互補菌株鑒定

以辣椒溶桿菌 X2-3基因組 DNA為模板，HutC-F/HutC-R為引物擴(kuò)增LC_HutC，再連接pEASY-Blunt-Simple，經(jīng)PCR驗證得到重組質(zhì)粒pEASY-HutC；用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ從重組質(zhì)粒中將-HutC-切下，連接到表達(dá)載體 pBBR1-MCS5，經(jīng)酶切驗證獲得質(zhì)粒 pBBR1-HutC。將質(zhì)粒 pBBR1-HutC電轉(zhuǎn)入MT4090感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)慶大霉素（500 μg/mL）NA平板篩選、菌落PCR驗證（HutC-YF/HutC-YR）和序列測定，獲得互補菌株。

1.6 菌株生長曲線測定

分別挑取菌株 X2-3、MT4090和 MS4090單菌落于 50 mL NB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)24 h（28 ℃，220 r/min），再分別取活化菌液1 mL至新的NB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)，直至OD600為1.0；分別按1%接種量，轉(zhuǎn)接菌液到50 mL NB培養(yǎng)液相同條件下培養(yǎng)，間隔4 h取樣測定OD600值，并根據(jù)各階段的OD值繪制生長曲線，試驗重復(fù)3次。

1.7 菌株運動能力測定

采用 SWA培養(yǎng)基對各菌株的運動能力進(jìn)行測定[12]。按照 1.6的方法在 NB培養(yǎng)液中活化菌株X2-3，MT4090和 MS4090，至 OD600為 1.0；分別取2.5 μL菌液于SWA平板表面，28 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，以菌落直徑評估各菌株運動能力，試驗重復(fù)3次。

1.8 菌株定殖能力測定

將質(zhì)粒pBBR1-GFP分別電轉(zhuǎn)入菌株X2-3，MT4090和MS4090中。收集10日齡小麥根系，并取小麥根尖1.5 cm置于200 μL上述含pBBR1-GFP的不同細(xì)菌培養(yǎng)物（OD600=1.0）中，28 ℃培養(yǎng)3～5 d；之后用無菌水清洗小麥根 3次；采用兩種方法測定菌株的定殖能力：（1）菌落計數(shù)法：經(jīng)上述處理的根系分別轉(zhuǎn)移至含1 mL無菌水的離心管中充分振蕩20 min，取100 μL振蕩液均勻涂布于NA卡那霉素（50 μg/mL）平板上，以各菌株在平板上的菌落數(shù)來評估菌株的定殖能力，試驗重復(fù)3次。（2）GFP測定：激光共聚焦觀察不同菌株處理的小麥根系，根據(jù)各處理根系熒光分析定殖情況，試驗重復(fù)3次。

1.9 菌株對小麥根系分泌物趨化能力測定

小麥根系分泌物的收集：使用傳統(tǒng)的水培收集法，將用無菌水沖洗干凈的植物根系放入裝有無菌水的無菌容器中培養(yǎng)一周，之后將植株移走，收集培養(yǎng)液，過濾、濃縮，得到根系分泌物以備后用。

采用毛細(xì)血管法進(jìn)行測定[14]：毛細(xì)玻璃管（內(nèi)徑為 0.5 mm）一端吸入小麥根系分泌物，另一端則用熱熔膠密封。將毛細(xì)玻璃管插入到含500 μL菌液的1 mL離心管中，常溫孵育60 min。用無菌水將毛細(xì)玻璃管外壁附著的菌液去除，然后將毛細(xì)玻璃管折斷，把內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，并加入50 μL無菌水稀釋，再將溶液吸出均勻涂布于NA平板上。25 ℃靜置培養(yǎng)24 h，以毛細(xì)玻璃管中的單菌落數(shù)來衡量菌株對小麥根系分泌物的趨向能力，試驗重復(fù)3次。

1.10 菌株生物膜產(chǎn)量測定

結(jié)晶紫染色法對各菌株的生物膜產(chǎn)量進(jìn)行測定。按照 1.6的方法活化培養(yǎng)各菌株至 OD600為 1.0；分別取1%的菌液于10 mL的NB培養(yǎng)液中，28 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d。慢慢去除試管中的菌液，再用相同體積的無菌水清洗試管內(nèi)壁2～3次，小心去除清洗液，然后試管中加入等體積的0.2%的結(jié)晶紫溶液，靜置20 min。小心去除染色液，用相同體積的無菌水清洗試管內(nèi)壁2～3次，并用37 ℃烘箱烘干試管內(nèi)壁。最后試管中加入2 mL無水乙醇溶解紫色物質(zhì)，并測定OD575下的吸光值。以O(shè)D575值的大小評估不同菌株生物膜產(chǎn)量，試驗重復(fù)3次。

1.11 菌株抑菌作用測定

平板對峙法對各菌株的抑菌活性進(jìn)行測定。按照 1.6的方法在 NB培養(yǎng)液中活化菌株 X2-3，MT4090和 MS4090至 OD600為 1.0；分別取2 μL菌液于PDA平板上，待菌液完全被吸收后，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2 d。再將病原菌菌餅接種于已接種細(xì)菌的平板中央，28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，5 d之后觀察并記錄各菌株對病原菌的抑菌圈直徑。以抑菌圈直徑大小評估不同菌株的抑菌能力，試驗重復(fù)3次。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計與分析。每種處理的條形圖上的不同字母表示通過Duncan的多重范圍檢驗在P＜0.05處存在顯著差異，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因分析

經(jīng)氨基酸序列比對，該預(yù)測蛋白與功能明確的惡臭假單胞菌P.putidaPBS1（GenBank登錄號：P22773.1）和大腸桿菌E.coliMS115-1（GenBank登錄號：EFJ97394.1）中的HutC氨基酸測序相似性分別為42.86%和41.04%（圖1A）。

根據(jù)X2-3（GenBank登錄號：LBMI00000000.1）全基因組序列，編號為LC4090的基因編碼HutC轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，該預(yù)測蛋白有兩個重要的結(jié)構(gòu)域，即HutC亞家族保守的HTH/DNA結(jié)合域和UTRA/配體結(jié)合域（圖1B）。

2.2 突變體與互補菌株的構(gòu)建

將重組載體pBR325-AnptIIB電擊轉(zhuǎn)化至菌株X2-3感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素篩選，菌落PCR驗證，初步獲得敲除突變體，命名為MT4090。PCR驗證結(jié)果如圖2A，其中泳道1擴(kuò)增出約2492 bp的條帶，大小與-AnptIIB一致，泳道2條帶大小約2225 bp，與對照-AHutCB一致；對該菌株進(jìn)一步序列測定，所測MT4090的核苷酸序列與預(yù)期結(jié)果一致，說明獲得的突變體MT4090為LC_HutC敲除突變體。

圖2B是互補菌株篩選結(jié)果。重組載體pBBR1-HutC轉(zhuǎn)化菌株MT4090細(xì)胞后，菌落PCR驗證發(fā)現(xiàn)，突變菌株MT4090擴(kuò)增不到代表部分LC_HutC的423 bp的條帶，而互補菌株、野生株X2-3都可以得到423 bp的條帶，說明互補菌株正確，命名為MS4090。

圖2 突變體驗證Fig.2 Confirmation of mutants

2.3 突變體生長能力分析

分光光度計法測定不同時間菌液OD600吸光值，繪制生長曲線（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在快速生長階段（20～36 h），MT4090的生長速度顯著低于X2-3和MS4090。在穩(wěn)定生長階段（40 h之后），MT4090的生長速度與X2-3差異不顯著，且增長速率趨于穩(wěn)定。說明LC_HutC基因的缺失使菌體生長早期顯著減弱，后期（40 h后）生長能力基本穩(wěn)定。

圖3 不同菌株生長能力分析Fig.3 Growth rate of mutants and wild type strain

2.4 突變體運動能力分析

運動性是PGPR細(xì)菌向宿主植物根系趨向性運動的重要方式[15]。采用SWA平板測定各菌株的運動能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT4090的運動區(qū)直徑比X2-3減少了近60%，而MS4090與X2-3運動區(qū)直徑相近，表明突變體MT4090的運動能力顯著減弱（圖4）。

圖4 不同菌株運動能力分析Fig.4 Motility of mutants and wild type strain

2.5 突變體定殖能力分析

PGPR在植物根部成功定殖是其發(fā)揮作用的前提[16]。采用激光共聚焦觀察和平板計數(shù)法測定各菌株的定殖能力，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，突變體在根系定殖能力顯著降低（圖 5A）；進(jìn)一步用平板計數(shù)法測定根系活菌數(shù)，發(fā)現(xiàn)突變體MT4090在小麥根上的活菌數(shù)為7.2×106CFU/g根，與野生株X2-3相比，減少了9×106CFU/g根，而互補菌株MS4090與X2-3在根上的活菌數(shù)沒有顯著差異，表明MT4090對小麥根的定殖能力顯著降低（圖5B）。

圖5 不同菌株對小麥根系的定殖能力Fig.5 Colonization of mutants and wild type strain to wheat roots

2.6 突變體對小麥根系分泌物趨化能力分析

植物根系分泌物是誘導(dǎo)PGPR及其他微生物趨向運動的重要成分，對微生物在根系定殖發(fā)揮重要作用[14,17]。采用毛細(xì)玻璃管法測定了各菌株的趨化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用毛細(xì)管吸取相同量（20 μL）的根系分泌物，經(jīng)系列標(biāo)準(zhǔn)處理后，突變體MT4090在毛細(xì)管中的活細(xì)胞數(shù)約為野生株X2-3的40%，說明LC_HutC的缺失導(dǎo)致菌株X2-3對小麥根系分泌物趨化能力明顯降低（圖6），而互補菌株比X2-3略有降低，但差別不顯著。

圖6 不同菌株對小麥根系分泌物的趨化性分析Fig.6 Chemotaxis of mutants and wild type strain to wheat root exudates

2.7 突變體生物膜產(chǎn)量分析

細(xì)菌生物膜形成有利于PGPR菌株抵抗環(huán)境壓力，從而在根系微環(huán)境中發(fā)揮作用[18]。結(jié)晶紫染色法對菌株X2-3、MT4090和MS4090的生物膜產(chǎn)量進(jìn)行測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體MT4090生物膜的產(chǎn)量顯著高于野生型X2-3和突變體MS4090（圖7A），約為野生株X2-3和突變體MS4090的兩倍（圖7B），說明LC_HutC的缺失顯著提高了菌株X2-3的生物膜產(chǎn)量。

圖7 不同菌株生物膜形成能力分析Fig.7 Biofilm formation of mutants and wild type strain

2.8 突變體抑菌作用分析

為了解LC_HutC是否與X2-3的抑菌活性有關(guān)，測定了突變體和野生型菌對真菌和卵菌的抑菌活性，結(jié)果如圖8所示?？梢奨2-3，MT4090和MS4090對植物病原真菌和卵菌的抑菌圈直徑?jīng)]有明顯差異，說明LC_HutC缺失對X2-3的抑菌作用沒有明顯的影響。

圖8 不同菌株抑菌作用分析Fig.8 Antimicrobial activity of mutants and wild type strain

3 討論

本研究分析了辣椒溶桿菌X2-3中一個LC_HutC對菌體生長、定殖及生物膜產(chǎn)量等的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)LC_HutC基因的缺失使菌體的生長速度、運動能力、定殖能力及對根系分泌物的趨向性等都顯著下降，生物膜產(chǎn)量明顯提高，但對病原真菌和卵菌的抗菌能力沒有明顯影響，表明LC_HutC對X2-3的調(diào)控作用是一個復(fù)雜的過程。

有效的根系定殖是PGPR菌株促進(jìn)植物生長和發(fā)揮防病作用的基礎(chǔ)，研究表明植物根系分泌物可作為信號分子直接或間接影響有益微生物向根系移動和定殖，是調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[19,20]。PGPR菌株在植物根系的定殖受多種基因的調(diào)節(jié)，Gao等[21]發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌B.cereus905在小麥根系的定殖能力受RecA基因調(diào)控，RecA基因缺失后，不僅使蠟樣芽胞桿菌的運動能力顯著降低，而且在根系的定殖能力比野生株減少1000-2500倍。Roberts等[22]在對陰溝腸桿菌Enterobactercloacae501R3的研究中發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌501R3的degS基因（編碼周質(zhì)絲氨酸蛋白酶）經(jīng)插入突變后，該菌株對黃瓜根系分泌物的趨向性明顯減弱，對根系定殖和對終極腐霉Pythiumultimum的防病效果也顯著降低，表明菌體的趨化性、根系定殖及運動能力對PGPR菌株發(fā)揮功能有重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，LC_HutC的缺失使辣椒溶桿菌X2-3的定殖和趨向運動都顯著減弱，表明LC_HutC對X2-3發(fā)揮生物學(xué)功能有重要的調(diào)控作用，這也是關(guān)于HutC調(diào)控辣椒溶桿菌定殖和趨向運動的首次報道。

生物膜是由胞壁多糖、胞外蛋白和胞外多糖等組成的復(fù)雜成分，一般認(rèn)為，形成生物膜有助于 PGPR菌株在根系有效定殖[18,23]，不少研究結(jié)果也對支持這種觀點，如Zhu等[24]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B.pumilusHR10可以在馬尾松幼苗的根部持續(xù)定殖，而生物膜形成基因缺失突變體則表現(xiàn)定殖能力減弱。但生物膜結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，受環(huán)境、營養(yǎng)及細(xì)菌種類等影響，不同細(xì)菌生物膜產(chǎn)量與細(xì)菌的定殖、運動并非完全一致。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，青枯病菌Ralstoniasolanacearum中一個編碼組裝蛋白（assembly protein）的基因TapV缺失，突變體定殖、運動能力等均顯著降低，但生物膜產(chǎn)量比野生株顯著提高。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌P.aeruginosa中GntR/MpaR基因缺失，生物膜產(chǎn)量顯著增加，但其在小鼠體內(nèi)定殖能力顯著減弱。這些結(jié)果與本研究結(jié)果類似。本研究中發(fā)現(xiàn)，LC_HutC突變體的生物膜產(chǎn)量比野生株X2-3明顯增加，但定殖能力及趨向運動等顯著減弱，表明LC_HutC對生物膜的形成可能有不同的作用，但詳細(xì)調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，GntR參與調(diào)控原核生物的多種生物學(xué)過程。對柑橘黃單胞菌X.citri和十字花科黑腐病菌X.campestris等植物病原細(xì)菌的研究中，發(fā)現(xiàn)GntR不僅調(diào)節(jié)細(xì)菌的III型分泌系統(tǒng)、運動性和對寄主的黏附力[27]，而且調(diào)節(jié)胞外多糖、胞外纖維素酶等基因的表達(dá)[28]。在變異鏈球菌Streptococcus mutans中，GntR對EPS產(chǎn)生、生物膜形成和糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)等都有不同的調(diào)節(jié)作用[29]。產(chǎn)酶溶桿菌L.enzymogenes是一種重要的PGPB菌株，其GntR的敲除不僅使菌體喪失了蹭行運動，而且降低了HSAF的產(chǎn)量[30]，表明GntR在該菌株中參與抗菌物質(zhì)HSAF的合成。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，辣椒溶桿菌X2-3中的HutC轉(zhuǎn)錄因子主要調(diào)節(jié)菌體的定殖、趨向運動和生物膜形成等，但對病原真菌和卵菌的抗菌能力沒有明顯影響，表明，HutC在不同菌株中有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。