資 力，劉廣林，張文成，夏時海，許 威

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常見的消化道急癥和重癥，發(fā)病機(jī)制主要包括消化酶的過早激活、炎性反應(yīng)和腺泡細(xì)胞死亡。盡管既往相關(guān)研究已經(jīng)很多，但AP過程中腺泡細(xì)胞損傷的分子機(jī)制仍未完全闡明。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER-stress，ERS)是一種以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯誤折疊蛋白的積累為特征的細(xì)胞功能障礙狀態(tài)。胰腺腺泡細(xì)胞作為消化酶的主要合成來源，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常豐富，使得腺泡細(xì)胞易受到AP過程中各種炎性反應(yīng)因子的誘導(dǎo)，從而發(fā)生ERS。嚴(yán)重和持久的ERS會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，線粒體釋放更多的細(xì)胞色素C，并且誘導(dǎo)Caspase12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，干擾體內(nèi)鈣調(diào)節(jié)通道，進(jìn)而引起不可逆的細(xì)胞損傷。鋅指蛋白580(zinc finger protein 580，ZFP580)是由張文成教授克隆出的一種新發(fā)現(xiàn)的DNA結(jié)合蛋白，前期研究結(jié)果表明ZFP580與胰腺纖維化、胰腺慢性炎性反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程及IL-6、ROS、NF-κB等炎性因子之間有密切關(guān)聯(lián)，檢索GEO數(shù)據(jù)庫顯示人乳腺癌細(xì)胞系中ZFP580表達(dá)與未折疊蛋白反應(yīng)下游效應(yīng)因子Xbp-1s的表達(dá)呈現(xiàn)一定相關(guān)性，BGEE數(shù)據(jù)庫顯示經(jīng)基因測序ZFP580在鼠胰腺組織有表達(dá)。本研究以探索胰腺腺泡細(xì)胞炎性反應(yīng)過程中，ZFP580與ERS相互作用的具體途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料 大鼠AR42J購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，由武警特色醫(yī)學(xué)中心消化疾病研究所保種。RPMI1640培養(yǎng)液(美國Hyclone)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶)；胎牛血清FBS(美國Gibico)；DMSO(美國Sigma)；IRE1阻斷劑MKC-3946(美國Sigma)；6/12/24/96孔板(美國Thermo Fisher)；β-actin抗體(德國羅氏)；山羊抗兔熒光二抗(武漢Proteintech)；XBP-1s抗體(美國Abcam)；Chop抗體(沈陽萬類生物科技)；Caspase-3抗體(沈陽萬類生物科技)；ZFP580抗體(美國Abcam)；轉(zhuǎn)膜槽(美國Bio-Rad)；電泳儀(美國Bio-Rad)；7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Appllied Biosystems)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出存放的AR42J細(xì)胞，解凍后加入培養(yǎng)液，在設(shè)置好的孵育箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。待觀察皿內(nèi)細(xì)胞生長至基本飽和(密度90%以上)時，傳代以使細(xì)胞繼續(xù)生長。

1.2.2 細(xì)胞干預(yù)與分組 依照實(shí)驗需求，IRE1阻斷劑(MKC-3946)、慢病毒，蛙皮素在IRE1阻斷劑作用1 h后加入，根據(jù)處理方式分為普通對照組、單阻斷劑組、單蛙皮素刺激組、慢病毒轉(zhuǎn)染組、阻斷劑+蛙皮素刺激組及轉(zhuǎn)染+蛙皮素刺激組。

1.2.3 MTT法檢測蛙皮素作用時間對AR42J細(xì)胞活性影響 取AR42J細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按要求接種在96孔板內(nèi)，保留空白對照，余分別在0、4、8、12、16、20 h加入蛙皮素(終濃度為100 nM)，分別設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入10 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔換成150 μl的二甲基亞砜，震蕩10 min后測定各孔的吸光值，根據(jù)結(jié)果計算IC。

1.2.4 RT-PCR檢測ZFP580 mRNA的表達(dá) 收取6孔板中AR42J細(xì)胞提取RNA并平衡濃度，反轉(zhuǎn)錄cDNA后檢測目的mRNA水平。

1.2.5 細(xì)胞總蛋白提取及Western-blot檢測 收取AR42J細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，離心，取上清液。BCA法測定各組蛋白濃度，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別加入β-actin、ZFP580、Xbp-1s、Caspase-3、Chop單克隆抗體作為一抗，4 ℃過夜，經(jīng)TBST緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵育2 h，經(jīng)TBST緩沖液洗滌后，應(yīng)用ECL發(fā)光法顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.6 慢病毒沉默ZFP580 取生長狀態(tài)良好的AR42J細(xì)胞按要求接種在6孔板內(nèi)。于各組加入4E+6TU的慢病毒lv-zfp580-RNAi (73469-1)、CON313以及4 μl的病毒感染試劑HitransG轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染完成后分別于各組加入2 μg /ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選(重復(fù)進(jìn)行此步驟5次，以期轉(zhuǎn)染率達(dá)95%以上)。

1.2.7 Hochest33342染色檢測細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞處理后，加入Hochest固定液10 min，PBS沖洗2次，加入Hochest染色液0.5 ml孵育5 min，吸盡染色液后洗滌2次，而后封片置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 AR42J細(xì)胞炎性反應(yīng)過程中ERS啟動 蛙皮素能誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞炎性反應(yīng)過程，以100 nM 蛙皮素刺激后提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測以觀察炎性反應(yīng)過程中ERS相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，ER-Stress標(biāo)志物GRP78和效應(yīng)因子XBP-1s從4 h開始升高，ZFP580由8 h開始升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05，表1)，上述因子表達(dá)隨時間延長而逐漸增加。

2.2 蛙皮素作用時間對AR42J細(xì)胞活性影響 Cer造模時一般采用100 nM濃度，作用時間12～24 h。Cer對AR42J細(xì)胞活性的抑制呈時間依賴，為后續(xù)觀察細(xì)胞凋亡壞死結(jié)果，取細(xì)胞死亡一半的作用時間作為后續(xù)實(shí)驗的Cer干預(yù)時間，計算IC=19；即Cer濃度100 nM、作用19 h達(dá)到一個合適的平衡，得到實(shí)驗所需造模效果(圖1)。

2.3 應(yīng)用IRE1抑制劑(MKC-3946)后ZFP580表達(dá)情況 對GEO數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索后推測ZFP580可能位于UPR信號途徑之一的IRE1通路。使用IREI抑制劑(MKC-3946)抑制IRE1通路表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，抑制劑組的ZFP580的表達(dá)受抑制；WB結(jié)果(圖2)與PCR結(jié)果類似，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05，表2)，由此推測ZFP580與UPR反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，且位于IRE1下游。

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞 以慢病毒轉(zhuǎn)染沉默ZFP580得到低表達(dá)AR42J細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后RT-PCR和WB(圖3)驗證，沉默組ZFP580表達(dá)明顯下降，提示轉(zhuǎn)染成功(<0.05，表3)。

2.5 沉默ZFP580對IRE1通路影響 為進(jìn)一步明確ZFP580在IRE1通路中的位置，以Cer刺激AR42J造模，結(jié)果顯示：與對照組相比，低表達(dá)組XBP-1s的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05，表4)。

2.6 沉默ZFP580對細(xì)胞凋亡-壞死的影響 以AR42J細(xì)胞經(jīng)Cer干預(yù)后，使用Hochest染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化，從形態(tài)學(xué)結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組的壞死細(xì)胞比例要明顯高于普通AP組(圖4)。同時，WB法檢測相關(guān)凋亡蛋白Chop/Caspase-3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Cer刺激19 h后Chop的表達(dá)量，沉默ZFP580組要明顯高于普通AP組，而沉默ZFP580組中Caspase-3的表達(dá)要低于普通AP組(圖5)。證明沉默ZFP580后，AP過程中壞死比例增高，而Caspase-3與細(xì)胞凋亡相關(guān)，其表達(dá)下降證實(shí)凋亡比例相應(yīng)降低。

3 討 論

ERS啟動后發(fā)生的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)包含3條不同的信號途徑，分別是IRE1、ATF6和PERK。細(xì)胞受到炎性反應(yīng)因子的誘導(dǎo)時，IRE1通路啟動，產(chǎn)生活性轉(zhuǎn)錄因子XBP-1s，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有關(guān)于蛋白質(zhì)折疊和降解的基因轉(zhuǎn)錄。針對沉默XBP-1動物模型的研究揭示了XBP-1在胰腺外分泌中的重要作用，缺乏XBP-1的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的胰腺外分泌功能不全，出生后不久即因消化功能不全、營養(yǎng)不良導(dǎo)致死亡。有研究顯示，與野生小鼠相比，沉默XBP-1小鼠ERS標(biāo)志物GRP78/BIP以及UPR反應(yīng)通路蛋白ATF6和PERK明顯升高，同時對腺泡細(xì)胞分化標(biāo)記物檢測發(fā)現(xiàn)，其淀粉酶和彈性酶水平相較于野生小鼠降低了60%～70%。因此，IRE1/XBP-1這一信號通路對于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及損傷后的恢復(fù)非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cer刺激的AR42J中，沉默ZFP580可降低XBP-1s的表達(dá)，并影響凋亡因子Caspase-3的反應(yīng)水平，這提示了ZFP580可能通過調(diào)節(jié)腺泡細(xì)胞的凋亡水平來影響AP炎性反應(yīng)的程度。

Rasheva等發(fā)現(xiàn)，GRP78/BIP水平的變化可預(yù)示細(xì)胞是否進(jìn)入ERS狀態(tài)。由此猜測，ERS在胰腺炎初期即開始發(fā)揮作用。UPR反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子XBP-1s可調(diào)控ERS伴侶分子表達(dá)，在我們的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)AR42J細(xì)胞發(fā)生ERS后ZFP580的表達(dá)出現(xiàn)顯著升高，ERS標(biāo)志物GRP78和通路IRE1下游產(chǎn)物XBP-1s和凋亡相關(guān)因子Chop、Caspase-3的表達(dá)相繼增加，使用慢病毒下調(diào)ZFP580表達(dá)后，從PCR及WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)下游產(chǎn)物XBP-1s降低，而凋亡相關(guān)因子Caspase-3的表達(dá)也隨之下降。由此我們推測ZFP580在由蛙皮素誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞引起的ERS中發(fā)揮了重要作用，且XBP-1s可能是ZFP580在ERS途徑中的一個作用靶點(diǎn)。

在AP進(jìn)展過程中，胰腺腺泡細(xì)胞損傷是一個多因素介導(dǎo)的復(fù)雜生物學(xué)過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。腺泡細(xì)胞死亡是胰腺炎結(jié)局的一個重要影響指標(biāo)。細(xì)胞凋亡和壞死是程序性死亡的不同形式，在維持哺乳動物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面扮演重要角色。細(xì)胞的凋亡和壞死與AP炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。目前隨著研究的深入，胰腺腺泡細(xì)胞損傷的新機(jī)制不斷被闡明。長期激活的ERS會導(dǎo)致腺泡細(xì)胞產(chǎn)生凋亡反應(yīng)。Caspase活化已知有4種途徑:死亡受體途徑、線粒體途徑、顆粒酶B介導(dǎo)途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)途徑。大量研究發(fā)現(xiàn)，ERS后期通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和壞死來加重胰腺腺泡細(xì)胞的炎性反應(yīng)損傷，從而加速胰腺炎的病理過程。Chen等通過觀察急性水腫型和重型壞死性胰腺炎模型大鼠胰腺腺泡細(xì)胞死亡時發(fā)現(xiàn)，前者較后者凋亡指數(shù)高，壞死比例小。除了對腺泡細(xì)胞的研究，F(xiàn)onseca等發(fā)現(xiàn)ERS會影響胰島β細(xì)胞的功能甚至導(dǎo)致其死亡。ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可通過多種信號途徑實(shí)現(xiàn)，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而不是壞死或線粒體靶向性凋亡。而激活的XBP-1s可使JNK磷酸化，激活下游轉(zhuǎn)錄因子(如c-jun, c-fos和 Sap-1)并調(diào)節(jié)胞內(nèi)RNA穩(wěn)定性，影響細(xì)胞凋亡。

本研究通過Hochest染色發(fā)現(xiàn)，與對照AP組相比，沉默ZFP580組的壞死細(xì)胞比例明顯升高，這在WB結(jié)果(Chop表達(dá)量增加)中得到證實(shí)，同時Caspase-3的表達(dá)水平降低，證實(shí)凋亡比例下降。因此我們推測，體外實(shí)驗中ZFP580可能通過改善腺泡細(xì)胞炎性反應(yīng)過程中的凋亡壞死比例，來實(shí)現(xiàn)其在AP進(jìn)程中的保護(hù)作用。

總之，本研究通過體外研究發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡細(xì)胞通過ERS誘導(dǎo)了ZFP580表達(dá)，進(jìn)而在促進(jìn)腺泡細(xì)胞的凋亡同時減少壞死，進(jìn)而減輕AP的嚴(yán)重程度，值得進(jìn)一步研究。