肖倩倩 梁旭方 莊武元 蔡文靜

(1.華中農業(yè)大學水產學院,華中農業(yè)大學鱖魚研究中心,武漢 430070;2.長江經濟帶大宗水生生物產業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心,武漢 430070)

學習和記憶是所有動物普遍存在的特征。動物通過學習和記憶使其靈活地適應不斷變化的環(huán)境條件,其中重要的是通過學習記憶獲得新的覓食技能[1]和食物偏好[2—4]。動物的學習記憶過程涉及動物的多個行為過程,包括攝食行為、集群行為、個體識別及信息傳遞等[5—7]。盡管學習記憶研究主要是在哺乳動物和鳥類中[8],但也有研究報道,魚類中各種行為活動都受到學習記憶的影響[9]。在魚類適應環(huán)境的過程中面臨諸多挑戰(zhàn),例如避免被捕食者捕食,尋找食物及配偶選擇等。為此魚類憑借以往經驗,通過化學信號學習并判斷新捕食者的威脅程度[10],魚類通過空間記憶和社會學習增強了對捕食者的規(guī)避能力。魚類通過學習顯著提高了攝食效率[3,7],還能增強鑒定合適配偶的能力[3,11]。在這些魚類行為中,學習和記憶對魚類的攝食行為中起著決定性的作用。最近的幾項研究表明,在大麻哈魚(Onco-rhynchus keta)[12]、孔雀魚(Poecilia reticulata)[13]、褐鱒(Salmo trutta)[14]等魚可以通過學習記憶提高攝食效率及攝食偏好,而學習記憶能否在魚類攝食偏好,如馴食等過程中發(fā)揮作用,目前尚不明確。

學習記憶相關基因之一的原癌基因c-Fos(proto-oncogenec-Fos) 的表達是小鼠(Mus musculus)海馬區(qū)依賴性非空間記憶的形成和反復記憶所必需的[15]。有研究表明這c-fos基因的mRNA表達水平隨著長期記憶等神經元激活反應而上升[16]。早期研究發(fā)現動物的T1R (taste receptor type 1,T1R) 基因家族缺失或突變,以適應其特殊的攝食習性,例如大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)[17,18]。以上研究表明動物能夠通過位于味蕾上的鮮味受體感知食物的鮮味,從而影響動物的攝食及食性偏好。有研究揭示團頭魴體內鮮味受體t1r1(taste receptor type 1 member 1,t1r1)缺失,以適應植物食性[19]。通過草魚轉食前后的轉錄組數據發(fā)現,鮮味受體t1r1的基因表達也發(fā)生了顯著變化,

表明t1r1可能參與草魚食性分化過程中的調控。然而,學習記憶影響魚類攝食及食性的過程中是否存在學習記憶相關基因c-fos對味覺受體t1r1表達的調控以及如何調控,仍不清楚。有報道稱外界環(huán)境的變化可以通過表觀遺傳調控,尤其是DNA甲基化,影響基因的轉錄,最終改變魚類的表型性狀。例如通過基因控制區(qū)CpG島的甲基化來調節(jié)基因轉錄的啟動[20,21]。

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)食性奇特,自魚苗開口起就以活魚蝦為食,經過長期的馴化后才可以接受人工飼料[22],而長期馴食過程中的學習記憶促進了翹嘴鱖食性從活魚轉變?yōu)轱暳蟍23]。何珊等[24]對雜交鱖馴食性狀的轉錄組分析,發(fā)現學習通路中cfos基因差異表達。同時實驗室前期研究發(fā)現易馴食鱖與易馴食飼料鱖腦中味覺受體t1r1的mRNA表達及其啟動子甲基化模式與不易馴食鱖完全不同[25]。因此,本實驗以翹嘴鱖為研究對象,利用學習記憶通路相關抑制劑T-5224和KN-62處理鱖腦細胞,研究c-fos是否對味覺受體基因c-fos的表達存在調控作用及調控方式,為進一步探討學習記憶對魚類攝食調控的分子機制,并為改進翹嘴鱖人工飼料馴化技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物:實驗用魚為翹嘴鱖(體重100 g左右)取自華中農業(yè)大學鱖魚研究中心,用于后續(xù)分離翹嘴鱖腦細胞。實驗開始之前先將翹嘴鱖轉移到循環(huán)水養(yǎng)殖系統內暫養(yǎng)1周,魚缸水體體積為100 L,曝氣水養(yǎng)殖,水體pH維持在6.8—7.2,溶解氧含量維持在6.8—7.8 mg/L,每日正常投喂餌料魚,換水吸污,以維持翹嘴鱖穩(wěn)定正常生理狀態(tài)。

主要試劑:DL 2000 Marker(TaKaRa)、胎牛血清 (Fatal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、L15培養(yǎng)液 (Genom)、I型膠原酶 (Gibco)、兩性霉素B、硫酸慶大霉素、青鏈霉素雙抗 (HyClone 公司)、DPBS、Dimethyl sulfoxide (DMSO Sigma)、T-5224 (Med-ChemExpress)、KN-62 (MedChemExpress)

1.2 分離翹嘴鱖腦細胞

選取一尾狀態(tài)比較好的翹嘴鱖,用75%的酒精消毒,在超凈工作臺里剖取腦組織于 DPBS 中清洗,用剪刀鑷子去除多余的組織,然后將腦組織放入盛有AIM液的培養(yǎng)皿內浸泡消毒1.5h;吸掉培養(yǎng)皿中多余AIM液,用剪刀將腦組織剪成1 mm3大小的組織塊,將組織塊轉移到盛有膠原酶消化液的離心管中在28℃培養(yǎng)箱中消化2h;加入L15培養(yǎng)液輕輕吹打得到腦細胞,1000 r/min 室溫離心5min后棄上清,隨后再用L15培養(yǎng)液漂洗兩次(1000 r/min,室溫離心5min),最后將收集的腦細胞加入原代培養(yǎng)液重懸后接種到細胞培養(yǎng)瓶,于 28℃無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第4天更換原代培養(yǎng)液1次。在顯微鏡下觀察腦細胞的生長情況。本課題組已經采用Neu-N和β-tubulin免疫熒光細胞化學技術鑒定了腦細胞神經元純度[26]。在腦原代細胞分離至第三代之后,即進行實驗。將腦細胞擴大培養(yǎng),鋪板至6孔板中,每個孔盛放2.0 mL培養(yǎng)液,待細胞長滿后進行下一步實驗。

1.3 實驗設計及樣品采集

本實驗設置對照組與實驗組,對照組加入抑制劑的溶劑,實驗組加入不同濃度抑制劑。抑制劑用DMSO稀釋至適宜濃度,當鱖腦原代細胞分離至第三代之后,即可進行實驗。將腦細胞擴大培養(yǎng),鋪板至6 cm2平皿中,每個平皿盛放2.5 mL培養(yǎng)液,封口膜封口放入28℃無CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。大概4d細胞覆蓋率可達80%,使用無添加試劑的L15基礎培養(yǎng)基對原代細胞進行饑餓16—24h。抑制劑用DMSO稀釋至適宜濃度備用,吸除廢液后再用無添加試劑的L15基礎培養(yǎng)基進行清洗。吸取添加了抑制劑或緩沖液的L15基礎培養(yǎng)基刺激細胞(根據不同抑制劑的效用不同,添加的抑制劑量不同,本研究T-5224采用0、10、30和60 μmol/L處理濃度;KN-62采用200 nmol/L),封口膜封口,放入28℃無CO2恒溫培養(yǎng)箱中,根據不同抑制劑效用,決定抑制劑的刺激時間,本研究T-5224處理24h,KN-62處理2h。刺激時間到達后分別收集細胞中RNA和DNA進行后續(xù)實驗操作,樣品凍存于–80℃超低溫冰箱。

1.4 翹嘴鱖相關基因的 mRNA 表達水平分析

利用 TRIzol Reagent 試劑 (TaKaRa) 來提取翹嘴鱖腦原代細胞的總RNA,再用 HiScript II Q RT SuperMix for qPCR 逆轉錄試劑盒(諾唯贊)進行反轉錄得到cDNA。采用實時熒光定量 RT-PCR 方法測定腦細胞中c-fos和t1r1基因的mRNA表達水平。反應體系 (20 μL) 如下:SYBR Green Supermix 10 μL,F 0.4 μL,R 0.4 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8.2 μL。反應程序如下:95℃,5min;95℃,10s;退火溫度30s和延伸30s,共39個循環(huán)。每經過一個循環(huán),收集一次熒光強度信號,采用優(yōu)化的2–ΔΔC t法,以rpl13a基因的定量表達水平為內參進行相對表達量分析,每個樣品重復6次。本試驗所用到的熒光定量引物均采用Primer 5.0軟件進行設計,并由生工合成,引物序列見表 1。

1.5 翹嘴鱖t1r1基因DNA甲基化水平分析和亞硫酸氫鹽硫化PCR (BSP)

將收集的DNA樣品采用TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen,Beijing,China) 試劑盒說明書的標準步驟提取基因組DNA。采用EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research,Irvine,CA,USA)試劑盒說明書的標準步驟進行基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾。原理如下:基因組DNA中甲基化胞嘧啶堿基不轉變,同時,未甲基化胞嘧啶脫氨基并轉變成尿嘧啶,經亞硫酸氫鹽硫化PCR (Bisulphite Sequencing Polymerase Chain Reaction,BSP)擴增后為胸腺嘧啶,從而區(qū)別甲基化/未甲基化的兩類胞嘧啶。從實驗室翹嘴鱖全基因組中獲得t1r1的全序列[27],基因5′側翼區(qū)的序列,第一外顯子區(qū)的序列,ATG上游3500 bp的序列,提交至在線預測網站Methprimer(http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methpri mer.cgi) 進行預測以獲得CpG島 (CGI) 和候選CpG位點。魚類CpG島無明確定義,選擇默認參數并根據情況進行調整,默認搜索參數如下:CpG島片段大小 (Island size) ＞ 100 bp,GC堿基含量(GC Percent) ＞ 50.0%,CpG島觀察值/預測值 (Observed/Expected,Obs/Exp) ＞ 0.6。BSP引物由在線軟件MethPrimer 14.0推薦,然后用Primer 5.0檢測是否合格,比較后采用特異性高引物用于BSP的擴增(表 1)。采用Taqplus DNA Polymerase (Vazyme Biotech,Nanjing,China) 在Biometra Thermo cyclers (Biometra,G?ttingen,Germany) 儀器上進行PCR。PCR反應循環(huán)參數為:94℃預變性5min;然后如下程序進行40個循環(huán),即94℃變性30s,52℃(根據不同引物的退火溫度)退火30s,72℃延伸30s;之后72℃延伸7min,最終12℃降溫10s后結束。采用Gel Purification Kit (Sangon,Shanghai,China) 試劑盒純化PCR產物,然后克隆至載體pMD18-T clone vector(TaKaRa,Tokyo,Japan) 中。在每個實驗組中,先隨機選取2個樣品進行預擴增及分析,存在DNA甲基化后檢測全部6個樣品。每個樣品隨機選取5個陽性克隆送至上海生工 (ABI3730 測序儀,Applied Biosystems) 進行測序,每個馴食實驗組總共收集成功測序的30個陽性克隆,經測序得到DNA序列。采用在線網站QUMA (QUantification tool for Methylation Analysis) (http://quma.cdb.riken.jp/) 將測序序列與亞硫酸氫鹽修飾前原序列進行比對分析,根據比對結果確定候選CpG位點是否發(fā)生甲基化以及甲基化水平。

表1 實時熒光定量 PCR 的引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of the primers for real-time PCR

1.6 統計分析

采用軟件SPSS 22.0 (IBM,Chicago,IL,USA)的Shapiro-Wilk法標準化數據,進行單因素方差分析。檢查方差齊性之后,通過Duncan’s multiple range test (MRT) 法檢測均值間差異。實驗組組間候選CpG位點甲基化水平的差異使用2×2卡方檢驗(χ2test)分析,實驗組組間基因表達水平的差異使用獨立樣本T檢驗分析,P＜0.05判定顯著差異,P＜0.01判定為極顯著差異。所有數據表示為平均值±SEM(平均值的標準誤差)。

2 結果

2.1 T-5224刺激鱖腦細胞后學習記憶因子c-fos及味覺受體t1r1 mRNA表達水平變化

使用學習記憶因子c-fos的抑制劑T-5224處理鱖腦原代細胞,利用RT-PCR技術比較使用T-5224抑制劑處理鱖腦細胞24h后,對照組0和實驗組nμmol/Lc-fos和t1r1(n表示不同濃度)mRNA水平(圖 1)。不同的實驗條件刺激鱖腦原代細胞得到不同的結果,圖 1A中不同濃度的T-5224處理與對照組相比,c-fosmRNA的表達水平均顯著降低(P＜0.05),而10 μmol/L處理效果最明顯,30 μmol/L次之。與此同時在圖 1B中不同濃度的T-5224處理與對照組相,t1r1mRNA的表達水平均顯著降低(P＜0.05),而30和60 μmol/L處理效果最明顯。

圖1 不同濃度T-5224處理c-fos和t1r1基因表達水平檢測Fig.1 Detection of c-fos and t1r1 gene expression level treated with different concentrations of T-5224

2.2 KN-62刺激鱖腦細胞后學習記憶因子c-fos及味覺受體t1r1 mRNA表達水平變化

使用學習記憶通路CAMKII抑制劑KN-62處理鱖腦原代細胞,參考彭建等[23]的選定最佳時間點和藥物濃度,我們選定2h這個時間進行對照組0和實驗組200 nmol/L濃度抑制劑刺激實驗(圖 2),在200 nmol/L-2h的刺激條件下,c-fosmRNA表達水平呈現極顯著上升趨勢 (P＜0.01),與此同時在相同處理條件下t1r1mRNA表達水平也呈現極顯著上升趨勢(P＜0.01)。

圖2 KN-62處理后c-fos和t1r1基因表達水平檢測Fig.2 Detection of c-fos and t1r1 gene expression level after KN-62 treatment

2.3 T-5224和KN-62刺激鱖腦細胞后味覺受體t1r1基因DNA甲基化水平的變化

我們分析了t1r1起始密碼子(指定為1)至上游–3500 bp處的CpG島。在翹嘴鱖t1r1基因的這一區(qū)域中存在一個CpG島,CpG 島全長為 177 bp。從t1r1基因結構圖中看到預測 CpG 島中 9 個候選CpG 位點的分布情況,它們分別位于–3085、–3071、–3062、–3049、–3041、–2988、–2981、–2973 和–2965 bp (圖 3)。通過前期抑制劑濃度和處理時間的最適篩選,抑制劑T-5224 30 μmol/L和KN-62 200 μmol/L處理發(fā)現,T-5224處理組與對照組各CpG位點發(fā)生甲基化甲基化的概率很高,但都無顯著性差異,而KN-62處理組與對照組各CpG位點發(fā)生甲基化甲基化的概率也很高,但是也都無顯著差異(表 2;圖 4)。

圖4 翹嘴鱖不同濃度抑制劑處理后t1r1基因各個CpG位點DNA甲基化水平Fig.4 DNA methylation level of each CpG site of t1r1 gene treated with different concentrations of inhibitors in Siniperca chuatsi

表2 不同處理后t1r1的5′-側翼區(qū)域中CpG島中每個CpG位點的甲基化概率Tab.2 Methylation status of each CpG (cytosine-guanine) site in the CpG island in the 5′-flanking regions of t1r1 (taste 1 receptor member 1) after different treatment

圖3 翹嘴鱖t1r1基因CpG島分布及CpG位點信息Fig.3 The distribution and locations of CpG islands of t1r1 gene

3 討論

3.1 學習記憶因子c-fos對翹嘴鱖味覺受體t1r1基因調控表達分析

本研究結果表明抑制劑T-5224在10—30 μmol/L對抑制c-fos的轉錄水平效果最佳,與此同時t1r1的轉錄水平也受到了抑制效果。而抑制劑KN-62的結果相反,KN-62處理后c-fos及t1r1的表達水平都顯著升高。T-5224作為特異性抑制c-Fos/c-Jun的DNA結合活性而不影響包括NF-κB在內的其他轉錄因子的結合活性的抑制劑[28,29],其可以抑制cfos基因mRNA的轉錄表達[30]。同時KN-62作為CaMKII的特異性激酶,可以使得CaMKII不能發(fā)生磷酸化而處于無活性狀態(tài)[31],同時研究報道由CaMKII引起磷酸化后的CREB能引發(fā)基因表達[32],而磷酸化后被激活的CREB參與c-fos基因的轉錄[33],我們結果與此一致。有研究報道,c-fos的表達是小鼠海馬區(qū)依賴性非空間記憶的形成和反復記憶所必需的[15],而學習記憶可以影響魚類攝食及食性的過程[34]。我們之前的研究表明,c-fos可能是影響魚類馴食的關鍵基因[23]。而味覺受體t1r1就是馴食基因之一,它不僅是鮮味感覺受體,在動物鮮活餌料識別過程中發(fā)揮關鍵作用,還在最近的研究中被發(fā)現可結合神經遞質在腦中海馬區(qū)表達,與學習記憶相關[35—38]。竇亞琪等[25]通過翹嘴鱖活體研究表明c-fos的變化可能影響味覺受體t1r1的mRNA的轉錄水平,從而影響鱖魚馴化后接受人工飼料。本研究首次在翹嘴鱖腦細胞證實了抑制劑T-5224對cfos的負調控和KN-62對c-fos的正調控,同時表明cfos作為一個轉錄因子很可能調控了翹嘴鱖味覺受體基因t1r1,從而影響其攝食偏好。

3.2 學習記憶因子c-fos對翹嘴鱖味覺受體t1r1基因DNA甲基化水平分析

DNA甲基化可能參與到精確調節(jié)基因表達使物種適應環(huán)境[38]。DNA甲基化調控機制已在多個領域中進行研究,包括生態(tài)毒理學,性發(fā)育和遺傳育種[40—42],然而在攝食性狀與記憶形成之間聯系的方面尚沒有任何研究[43]。大熊貓t1r1的假基因化與大熊貓從肉食性向草食性的轉化密切相關[17,18],進一步有研究發(fā)現,在不同程度馴食翹嘴鱖研究中發(fā)現,鱖腦中c-fos轉錄水平變化的同時,t1r1基因調控區(qū)的DNA甲基化水平也發(fā)生變化,從而造成t1r1基因的轉錄水平變化。T1r1的DNA甲基化對鱖攝食死餌料魚的記憶再鞏固和穩(wěn)定至關重要,因此cfos可能通過t1r1基因DNA甲基化參與調控t1r1轉錄水平[25]。本研究結果中t1r1基因在兩種抑制劑的處理下其各位點及總體甲基化的概率都較高,但是基本無差異。與竇亞琪等[25]的結果不一致,這種差異可能是由于體外實驗與體內實驗的潛在差異造成的。在細胞水平上,鱖腦細胞中c-fos可能通過未知其他途徑調控t1r1的轉錄水平。

4 結論

綜上所述,本研究我們比較了兩種抑制劑T-5224和KN-62對翹嘴鱖腦味覺受體t1r1基因mRNA表達及DNA甲基化的影響,結果表明c-fos可能影響味覺受體t1r1的轉錄水平,但不通過t1r1基因DNA甲基化影響其轉錄水平。同時我們首次在魚類上證實T-5224對c-fos的負調控及KN-62對c-fos的正調控作用。為進一步了解學習記憶促進魚類新食性形成的作用機制,并通過有效提高鱖魚學習記憶能力來解決鱖魚飼料養(yǎng)殖過程中難馴化及馴化不穩(wěn)定問題提供了理論依據。