姜玉山 宋亞彩 方玲 呂菲 張沛東

(中國海洋大學,海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,青島 266003)

刺參(Apostichopus japonicus)是重要的食用參種,因其較高的營養(yǎng)價值在我國被列為“海八珍”之一[1]。隨著我國人民生活水平提高,市場對刺參的需求不斷增加,刺參增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展迅速增長[2]。根據(jù)刺參的生態(tài)習性,利用人工海珍品礁進行刺參增養(yǎng)殖目前得到廣泛應用。張艷等[3]調(diào)查了投放海珍品礁前后刺參增殖區(qū)沉積物粒徑的變化,發(fā)現(xiàn)礁體投放后增殖區(qū)沉積物的中值粒徑和平均粒徑均高于非礁區(qū),礁體投放改變了周圍水體的水動力學特征,導致增殖區(qū)海底底質(zhì)粗糙化,利于刺參的附著及活動。丁增明等[4]研究發(fā)現(xiàn),通過投放海珍品礁體進行刺參增養(yǎng)殖,刺參存活率可達60%以上,且刺參無病害、生長快。但近年來受氣候變化和人類活動影響,刺參增殖區(qū)底部海水缺氧等極端環(huán)境變化時有發(fā)生,對刺參增養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重威脅。劉國山等[5]報道,2013年威海雙島灣人工魚礁區(qū)由于底部海水嚴重缺氧引發(fā)刺參大規(guī)模死亡。因此,進一步探究適宜的天然綠色生境,對實現(xiàn)刺參增養(yǎng)殖的可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn),鰻草(Zostera marina)海草床是刺參的天然棲息地,其對刺參具有較強的養(yǎng)護作用。鰻草碎屑不僅可作為刺參的直接食物來源[6],而且可顯著提高刺參的免疫水平,如唐薇等[7]研究發(fā)現(xiàn),刺參攝食鰻草碎屑后,其體腔液的免疫酶活性高于未攝食鰻草碎屑的對照組,其中超氧化物歧化酶活性是對照組1倍。此外,鰻草生境還利于提高刺參的存活率,如劉元剛等[8]通過刺參生態(tài)養(yǎng)殖實驗發(fā)現(xiàn),刺參在鰻草圍堰的存活率為35%,顯著高于無鰻草植株的其他圍堰。這些研究均證明,構建以鰻草海草床為生境載體的刺參綠色生態(tài)牧場具備廣闊的應用潛力。

為明確刺參對不同生境的選擇性及其行為生理響應過程,在室內(nèi)人工條件下模擬了裸沙、石塊與鰻草生境,研究了刺參對不同生境的選擇性和偏好性,量化了刺參在不同生境的蠕動、攝食和排便行為特征,分析了不同生境條件下刺參肌肉ATP含量及體腔液兒茶酚胺類激素含量的差異,以期補充完善刺參行為生理生態(tài)學理論內(nèi)容,并為刺參綠色生態(tài)牧場的建設提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 幼參來源

實驗用幼參購自馬山集團有限公司,平均體重為10 g/頭,運至實驗室后使用16個42 cm×36 cm×33 cm(長×寬×高)的玻璃缸進行暫養(yǎng)。在暫養(yǎng)期間,保持海水水溫(17±1)℃,鹽度32±1,pH8.2—8.3,使用氣泵24h連續(xù)充氣并保證水體溶解氧含量≥6 mg/L,使用熒光燈營造日光條件(光照強度＞2000 lx,光照時長6:00—18:00)。每2天換水1次,換水量為玻璃缸水量的1/3。每天投喂商用幼參專用飼料(主要成分為鼠尾藻、馬尾藻和進口魚粉等),根據(jù)王曉艷等[9]對刺參餌料配置的研究,將投餌量設置為刺參體重的6%,并每天觀察刺參攝食情況及時調(diào)整投餌量。

1.2 實驗設計

刺參對不同生境的選擇性選取刺參典型資源分布區(qū)—山東省榮成市天鵝湖海草床及其周邊海域礁石區(qū)作為模擬生境[10]。在室內(nèi)營造鰻草生境、裸沙生境和石塊生境,研究刺參對不同生境的選擇性及光照條件(日光條件和黑暗條件)對刺參生境選擇性的影響。根據(jù)Xu等[11]調(diào)查的天鵝湖海草床的平均植株密度(200 shoots/m2)、Zhang等[12]調(diào)查的天鵝湖底質(zhì)狀況與礁石分布情況等,設置鰻草-裸沙組、鰻草-石塊組和石塊-裸沙組3個實驗組(表 1)。實驗期間使用的底泥均來自榮成天鵝湖的天然底泥,其底質(zhì)類型為砂質(zhì)粉砂及粉砂質(zhì)砂。

表1 實驗組的設置Tab.1 Setting of experimental groups

光照條件設置為日光條件(6:00—18:00)和黑暗條件(18:00—次日6:00),其中日光條件根據(jù)Yang等[13]的實驗結果,光照強度設置為2000 lx,黑暗條件時用黑幕包圍實驗水槽,其光照強度為0。

刺參對不同生境的偏好性及其行為生理響應過程按照選擇性實驗的方法,在圓形水槽同時設置裸沙生境、石塊生境和鰻草生境,研究刺參對不同生境的偏好性,并觀察刺參在不同生境的行為表現(xiàn)(運動、攝食和排泄行為),查明刺參的行為響應特性。在實驗結束后,采集刺參樣品,并選擇暫養(yǎng)條件下的刺參作為對照組,測定刺參肌肉的ATP含量和體腔液的兒茶酚胺類激素含量,以明確刺參在不同生境的生理狀態(tài)。

1.3 實驗裝置與過程

刺參對不同生境的選擇性刺參選擇性實驗采用3組方形水槽(圖 1)。每個水槽規(guī)格為96 cm×56 cm×60 cm(長×寬×高)。將水槽按照4∶1∶4的比例劃分為3部分,并用隔板隔開,從而在水槽中間的10 cm×56 cm長方形區(qū)域形成刺參緩沖區(qū),在緩沖區(qū)兩側隨機按照實驗組設置不同的生境。

圖1 鰻草-裸沙組(A)、鰻草-石塊組(B)和裸沙-石塊組(C)實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental apparatus of group ZS (A),group ZR (B),and group RS (C)

每次實驗時間為6:00至次日6:00。實驗開始前,各實驗組隨機選擇10頭刺參,將其放入中間緩沖區(qū)適應30min。實驗期間的環(huán)境條件與暫養(yǎng)條件保持一致。

實驗于6:00開始,打開各實驗組照明燈,營造日光條件(光照強度2000 lx),然后將各實驗組的隔板移除,使用目視法記錄刺參在各生境的分布狀態(tài),計算平均聚集率。

至18:00,關閉各實驗組照明燈,并用黑幕將實驗裝置圍遮,營造黑暗條件(光照強度0),記錄刺參在各生境的分布狀態(tài),計算平均聚集率。記錄時依次打開各實驗組照明燈,迅速記錄刺參分布狀態(tài),記錄后及時關閉照明燈。

至次日6:00,實驗結束,將各處理組刺參取出,移至暫養(yǎng)水槽不再使用,并變換實驗水槽位置以消除水槽位置對刺參生境選擇性的影響。實驗重復5次(n=5),期間不投餌以消除餌料對刺參選擇性的影響。

刺參對不同生境的偏好性及其行為生理響應過程刺參的偏好性實驗采用高110 cm、直徑160 cm的圓形水槽,在其中間選取直徑20 cm的圓形區(qū)域作為緩沖區(qū),其余空間平均分為3個區(qū)域,按照選擇性實驗的配置方法,隨機營造鰻草生境、裸沙生境和石塊生境(圖 2)。

圖2 刺參偏好性實驗的裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of apparatus in preference experiment of A.japonicus

每次實驗持續(xù)7d。在實驗開始前,隨機選擇20頭刺參,將其放入中間緩沖區(qū),并用圓形擋板將刺參與其他生境隔開,適應1d。實驗期間的環(huán)境條件與暫養(yǎng)條件保持一致,并按照選擇性實驗的方法營造光照條件。

在適應結束后,于正式實驗第1天的6:00移除圓形擋板,容許刺參隨機選擇各生境,持續(xù)6d。于實驗第7天的6:00開始,每1h使用目視法觀察并記錄刺參在各生境的分布狀態(tài)并錄像,第8天的6:00結束。

根據(jù)錄像統(tǒng)計刺參在各生境的蠕動、攝食和排泄行為響應。根據(jù)Sun等[14]的研究方法,刺參從肛門端至口端依次收縮,產(chǎn)生位移并恢復平靜狀態(tài)的過程視為刺參完成1次蠕動,刺參口端觸手伸縮,將食物送進口中的過程視為刺參完成1次攝食。收集刺參糞便,測量并記錄刺參糞便的長度和厚度。

在各生境隨機選取刺參3頭,并同期隨機選擇暫養(yǎng)條件下的刺參3頭作為對照組,解剖并收集刺參的體腔液,立刻用于兒茶酚胺類激素(皮質(zhì)醇、多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素)含量的測定,解剖后的刺參去除呼吸樹和石灰環(huán)并分離刺參的肌肉組織,用于刺參肌肉ATP含量的測定。

實驗結束,將刺參取出,移至暫養(yǎng)水槽不再使用,并隨機變換實驗水槽內(nèi)的生境位置以消除生境位置對刺參生境偏好性的影響。實驗重復5次(n=5),期間不投餌以消除餌料對刺參偏好性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理和樣品分析

平均聚集率(Mean attractive rate,MAR)根據(jù)林承剛[15]的研究,MAR計算公式如下:

式中,Ni為刺參每小時在某生境的分布數(shù)量,N為刺參總數(shù)量。

行為特征(1)蠕動頻率(Crawling frequency,CF)

根據(jù)Yang等[16]的方法,計算公式如下:

式中,C代表蠕動次數(shù);T代表觀察時間(min)。

(2)觸手伸縮頻率(Tentacles activity frequency,TAF)

根據(jù)Sun等[14]的方法,計算公式如下:

式中,TA為刺參完成觸手伸縮并舒張的次數(shù);T為觀察時間(min)。

生理狀態(tài)(1)肌肉ATP含量采用磷鉬酸比色法測定[17]。刺參解剖后將其肌肉與煮沸的去離子水按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例進行勻漿,勻漿液抽提1min后采用4000 r/min離心1min,取上清液,使用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒(A095-1-1)測定ATP含量。(2)刺參體腔液兒茶酚胺類激素含量采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)并參考丁奎[18]的樣品處理方法進行測定。取刺參體腔液,加入一定量的磷酸緩沖液,2000 r/min條件下離心20min,取上清液,使用江蘇酶標生物科技有限公司生產(chǎn)的多巴胺(MB-10128B)、腎上腺素(MB-21370B)、去甲腎上腺素(MB-21402B)和皮質(zhì)醇(MB-2229B)ELISA試劑盒測定4種兒茶酚胺類激素含量。

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用平均值±標準誤(mean±SE)表示。利用SPSS 25軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗分析比較在日光條件與黑暗條件下刺參平均聚集率的差異。采用單因素方差(One-way ANOVA)分析偏好性實驗中各生境刺參的平均聚集率、蠕動頻率、攝食頻率、糞便長度、糞便寬度、ATP含量、多巴胺含量、腎上腺素含量、去甲腎上腺素含量和皮質(zhì)醇含量的差異,若差異顯著,使用Duncan法進行組間差異性比較,以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結果

2.1 刺參對不同生境的選擇性

鰻草-裸沙組,刺參在鰻草生境的平均聚集率在70%—100%,顯著高于刺參在裸沙生境的平均聚集率(P＜0.05),平均是其5倍(圖 3A);石塊-裸沙組,刺參在石塊生境的平均聚集率在30%—80%,平均是裸沙生境的2倍(圖 3B);鰻草-石塊組,刺參在鰻草生境的平均聚集率在60%—90%,顯著高于刺參在石塊生境的平均聚集率(P＜0.05),平均是其2倍(圖 3C)。

圖3 鰻草-裸沙組(A)、石塊-裸沙組(B)和鰻草-石塊組(C)刺參平均聚集率的變化Fig.3 The change in MAR of A.japonicus in group ZS (A),group RS (B) and group ZR (C)

光照條件對刺參平均聚集率存在顯著影響(圖 4)。鰻草生境,刺參在黑暗條件下的平均聚集率達到80%,顯著高于日光條件的平均聚集率;石塊生境和裸沙生境,刺參在黑暗條件下的平均聚集率低于日光條件的平均聚集率,相比日光條件分別下降6%和10%。

圖4 不同光照條件對鰻草-石塊組(A)、石塊-裸沙組(B)和鰻草-裸沙組(C)刺參平均聚集率的影響Fig.4 The effect of different light conditions on the MAR of A.japonicus in group ZR (A),group RS (B) and group ZS (C)

2.2 刺參對不同生境的偏好性及其行為生理響應

刺參對不同生境的偏好性刺參對不同生境的偏好存在顯著差異,其在鰻草生境的平均聚集率達到48%,顯著高于刺參在其他2個生境的平均聚集率(P＜0.05),分別是裸沙生境和石塊生境的4倍和2.5倍(圖 5)。

圖5 不同生境對刺參平均聚集率的影響Fig.5 The effect of different habitats on the MAR of A.japonicus

刺參在不同生境的行為特征刺參在鰻草生境的平均蠕動頻率達到0.65/min,顯著高于其他兩個生境(P＜0.05),是石塊生境和裸沙生境的2倍(圖 6A)。刺參在鰻草生境的攝食活動顯著高于其他兩生境(P＜0.05),其觸手伸縮頻率達到0.43/min,是石塊生境的2倍(圖 6B)。刺參在鰻草生境的糞便長度和厚度顯著高于其他兩生境(P＜0.05),其糞便長度是石塊生境的1.9倍,糞便厚度是石塊生境的2.5倍(圖 6C和6D)。

圖6 不同生境對刺參蠕動頻率(A)、觸手伸縮頻率(B)、糞便長度(C)和糞便厚度(D)的影響Fig.6 The effect of different habitats on the crawling frequency(A),tentacles activity frequency (B),feces length (C) and feces thickness (D) of A.japonicus

刺參在不同生境的肌肉ATP含量刺參在鰻草生境的肌肉ATP含量達到860 μmol/g prot,顯著高于其他兩生境刺參肌肉ATP含量(P＜0.05),是石塊生境和裸沙兩生境的約2倍(圖 7)。

圖7 不同生境對刺參肌肉ATP含量的影響Fig.7 The effect of different habitats on the ATP content in the muscle of A.japonicas

刺參在不同生境的體腔液兒茶酚胺類激素含量刺參在鰻草生境的體腔液多巴胺含量為929 pg/mL,顯著高于對照組(P＜0.05),與石塊生境和裸沙生境的沒有顯著差異(P＞0.05;圖 8A)。刺參在石塊生境的體腔液皮質(zhì)醇含量為1340 pg/mL,顯著高于對照組及其他兩生境(P＜0.05),是鰻草生境和裸沙生境的1.1倍(圖 8B)。不同生境之間刺參體腔液的腎上腺素和去甲腎上腺素含量均無顯著差異(P＞0.05;圖 8C和8D)。

圖8 不同生境對刺參多巴胺(A)、皮質(zhì)醇(B)、去甲腎上腺素(C)和腎上腺素含量(D)的影響Fig.8 The effect of different habitats on the dopamine (A),cortisol (B),noradrenaline (C) and epinephrine contents (D) in cavity fluid of A.japonicas

3 討論

3.1 刺參的生境選擇性和偏好性

生境選擇性與偏好性實驗表明,刺參對鰻草生境具有較強的選擇和偏好,其中選擇性實驗顯示刺參在鰻草生境的平均聚集率可達60%以上,分別是石塊生境和裸沙生境的2倍和5倍;偏好性實驗顯示,刺參在鰻草生境的平均聚集率達到48%,分別是石塊生境和裸沙生境的2.5倍和4倍,研究結果與已有報道的結論類似。如王學廣[19]研究發(fā)現(xiàn),規(guī)格50 g的刺參對鰻草養(yǎng)殖區(qū)具有明顯的選擇性,其在鰻草生境的聚集率是泥沙生境的10倍;佟飛[20]研究表明,刺參一般選擇鰻草草床棲息,且鰻草草床對刺參有較好的增殖效果;高亞平等[21]發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖池塘中面積占比為60%的鰻草斑塊棲息的刺參數(shù)量可達養(yǎng)殖池塘刺參總數(shù)量的90%。刺參對鰻草生境的選擇和偏好可能與鰻草草床的遮陰作用與水質(zhì)凈化功能有關。王喜濤[22]發(fā)現(xiàn),榮成天鵝湖鰻草海草床在春夏季的光照強度約為臨近裸沙區(qū)的58%,日平均水溫低于裸沙區(qū),其明顯的遮陰作用為負趨光性的刺參提供了遮蔽場所。Carmen等[23]研究顯示,鰻草草床對氮和磷的吸收量分別可達0.8—1.8和0.04—0.07 kg/d,其強大的水質(zhì)凈化功能為海草床營造了良好的水質(zhì)條件,從而吸引刺參的棲息。

研究發(fā)現(xiàn),刺參對石塊生境也具有一定的選擇和偏好,其中石塊-裸沙組選擇性實驗顯示刺參在石塊生境的平均聚集率是裸沙生境的2倍,偏好性實驗刺參在石塊生境的平均聚集率為20%。實驗還發(fā)現(xiàn),刺參在石塊生境通常聚集在石塊底部的粗糙區(qū)域,僅個別刺參棲息在石塊表面,這可能與石塊顏色及表面粗糙程度有關。張輝等[24]研究發(fā)現(xiàn),刺參在黃色附著基的平均聚集率僅為相同形狀黑色附著基的10%。Sun等[25]發(fā)現(xiàn),冰島刺參(Cucumaria frondosa)在光滑石塊上平均聚集率是粗糙石塊的70%。本實驗使用的石塊表面較光滑,且石塊表面附著較多泥沙從而呈現(xiàn)與底泥相同的黃色,導致刺參的選擇不高。

刺參對裸沙生境的選擇性最低,其中選擇性實驗顯示,刺參在裸沙生境的平均聚集率低于40%,偏好性實驗刺參在裸沙生境的平均聚集率僅為16%,印證了刺參對沙質(zhì)和沙泥底質(zhì)有忌避效應的觀點。趙鵬等[26]研究發(fā)現(xiàn),刺參傾向于選擇粗砂和礫石比例較高的海底,對黏土、粉砂等比例較高的底質(zhì)選擇性較低;Dobson等[27]發(fā)現(xiàn),糙海參(Holothuria scabra)在粗糙底質(zhì)生境的攝食率更高。Hu等[28]研究顯示,刺參對底質(zhì)條件不利于其運動的生境的平均選擇率僅為對照組的30%。本實驗使用的底泥主要以砂質(zhì)粉砂及粉砂質(zhì)砂為主,不利于刺參的管足附著和運動,從而導致刺參在裸沙生境的平均聚集率較低。

研究發(fā)現(xiàn),光照條件對刺參平均聚集率存在顯著影響,其中鰻草生境中刺參在黑暗條件下的平均聚集率達到80%,顯著高于日光條件。Sun等[13]研究也發(fā)現(xiàn),當環(huán)境晝夜切換時,刺參會發(fā)生遷移活動。夜間是刺參攝食的主要時段,鰻草葉片及其附著生物是刺參的優(yōu)良餌料,從而導致黑暗條件下刺參向餌料豐富的鰻草生境移動,其在鰻草生境的平均聚集率顯著升高[29,30]。在黑暗條件下,刺參向鰻草生境的移動攝食,導致刺參在石塊生境和裸沙生境的平均聚集率相比日光條件下降。Dong等[31]也發(fā)現(xiàn),光照強度由500 lx下降至0時,刺參逐漸進行采食活動,棲息于遮蔽場所的刺參聚集率由90%下降至50%。

3.2 刺參在不同生境的行為特征

蠕動、攝食與排泄是刺參重要的生境適應性行為[32]。蠕動行為是刺參進行移動的主要形式[14]。刺參能夠通過口端的觸手感知食物存在,并使用觸手收集口部周圍的食物并送入口中。刺參排便行為則反應了刺參的消化能力[34]。本實驗結果發(fā)現(xiàn),刺參在鰻草生境的行為響應強烈,其蠕動頻率和觸手伸縮頻率是石塊生境和裸沙生境的2倍,糞便長度和厚度分別為石塊生境的2倍和2.5倍。

鰻草生境的底質(zhì)營造、餌料效應與復雜結構可能是刺參行為響應強烈的原因。研究發(fā)現(xiàn),刺參的運動能力與底質(zhì)條件密切相關,粗糙底質(zhì)可為刺參管足提供良好的附著基,促進刺參蠕動[33]。鰻草生境含有大量的鰻草碎屑,在生境底部形成了粗糙表面,從而利于刺參蠕動。鰻草碎屑也為刺參提供了大量的潛在食物來源,因此刺參在鰻草生境的食物豐富且來源更廣泛[35]。Hu等[28]研究發(fā)現(xiàn),刺參攝食時需要收縮腹部收集食物,從而消耗較多能量,而傾角60°的礁體為刺參提供了一定的輔助,促進其在礁體上的攝食頻率是無礁體區(qū)域攝食頻率的4倍。本實驗也發(fā)現(xiàn),刺參會黏附在鰻草葉鞘上進行攝食,這可能是因為鰻草結構為刺參提供了物理輔助,從而增加其攝食效率。

3.3 刺參在不同生境的生理特征

ATP是動物肌肉收縮的能量來源,因此ATP含量的變化對刺參的運動具有較大影響[35]。茹小尚[36]研究發(fā)現(xiàn),在刺參進入繁殖期后,其大量能量被用于性腺組織,肌肉組織ATP含量降低,導致刺參運動耐力下降。本研究發(fā)現(xiàn),刺參在鰻草生境的肌肉ATP含量為860 μmol/g prot,是石塊生境和裸沙生境的2倍,其在鰻草生境的活動比較旺盛。

研究發(fā)現(xiàn),兒茶酚胺類激素能夠作為信息傳導物質(zhì)影響動物的攝食、移動、呼吸、繁殖和免疫[35]。如Huo等[37]研究發(fā)現(xiàn),刺參夏眠時腎上腺素與去甲腎上腺素含量上升,從而補償刺參免疫活動的缺失。Pei等[38]比較了7 g/頭刺參在養(yǎng)殖密度分別為0.5和0.8 頭/L的皮質(zhì)醇含量與生長速率,發(fā)現(xiàn)在高密度條件下刺參的皮質(zhì)醇含量是低密度條件的1.5倍,且刺參的生長速率降低80%。本研究發(fā)現(xiàn),刺參在各生境的體腔液多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素含量均無顯著差異,可能是因為本實驗選擇的3種生境均是刺參較適宜的棲息生境,實驗期間刺參的放置密度也較適宜,因此并未對刺參產(chǎn)生脅迫作用。

綜上,刺參對鰻草生境具有明顯的選擇性,其在鰻草生境的行為活躍,生理狀態(tài)良好,說明鰻草草床是刺參綠色生態(tài)牧場構建的優(yōu)良生境。