肖愛愛，王雪艷，溫 敏, ，王正平,2,3,

（1.聊城大學生物制藥研究院，山東聊城 252000；2.聊城高新生物技術有限公司，山東聊城 252000；3.海門品尚醫(yī)藥科技有限公司，江蘇南通 226133）

D-核糖（D-ribose，DR）是一種五碳醛糖，天然存在于所有生命細胞中，參與三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）的合成，在能量代謝中起重要作用[1]。D-核糖作為磷酸戊糖途徑的產物，有助于磷酸戊糖途徑的循環(huán)，增強氧化酶活性，快速清除自由基，提高機體氧化系統(tǒng)的防御能力[2?3]。目前，D-核糖作為一種新食品原料，已廣泛應用于飲料、能量棒等多種食品加工中[4]。袁保輝等[5]和張振剛等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，補充D-核糖可以改善疲勞模型小鼠的心臟損傷，延長小鼠游泳時間并促進疲勞小鼠體能恢復；臨床研究表明，D-核糖對慢性疲勞綜合征[6]、纖維肌痛[7]和充血性心力衰竭患者舒張功能障礙[8]等具有一定的改善作用。此外，已有研究表明：補充D-核糖可以改善大鼠心肌缺血再灌注損傷[9?10]。以上研究結果表明，D-核糖具有一定的心臟保護作用。

近年來，癌癥的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重危害人類的健康[11]。阿霉素（Doxorubicin，DOX）作為蒽環(huán)類化療藥物的代表，是目前臨床最常用的高效廣譜抗腫瘤藥物之一，但因嚴重的心臟毒性限制了其應用[12]。研究表明，口服D-核糖對心臟具有保護作用，并能減輕順鉑介導的腎臟損傷[13]。然而，尚未見D-核糖對DOX 心臟毒性保護作用的報道。因此，本研究通過采用單次腹腔注射大劑量阿霉素（15 mg/kg）建立DOX 急性心臟毒性小鼠模型，通過檢測血清生化指標和心臟組織病理變化評價D-核糖對DOX 心臟毒性的保護作用，并進一步通過蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達揭示其潛在的分子機制，以期為DOX 心臟毒性的防治研究提供一定的參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

40 只ICR 雄性小鼠，8 周齡、體重25～30 g 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（中國濟南），實驗動物生產許可證號：SCXK 魯2019-0003。所有小鼠均于溫度（23±2）℃、濕度（45%±10%）、12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進食和飲水。動物實驗經(jīng)聊城大學倫理委員會批準（批準號20200803）。

D-核糖 江西誠志生物工程有限公司；鹽酸阿霉素（純度≥98%，貨號：D807083） 上海麥克林生化科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；脂質氧化（Malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、增強型ATP 檢測試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、總蛋白提取試劑盒 上海碧云天有限公司；脫脂奶粉（純度≥99%，貨號：D8340） 北京索萊寶科技有限公司；沉默信息調節(jié)因子2 相關酶類1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1）抗體 北京博奧森生物技術有限公司；4%多聚甲醛液、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體 武漢賽維爾生物科技有限公司；過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinecontaining aspartate specific protease 3，Caspase-3）、B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、HRPGoat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）抗體 Proteintech、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phophoate dehy-drogenase，GAPDH）抗體 Cell Signaling Technology。

Centrifuge 5804 R 高速臺式離心機 德國Eppendorf 公司；Tecan Spark?多功能酶標儀 瑞士TECAN 公司；PowerPac HC 美國伯樂高流電泳儀電源、Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直電泳槽、Trans-Blot SD 轉印槽 美國Bio-Rad 公司；Tanon-4600SF化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；OLYMPUS IX73 倒置顯微鏡 日本OLYMPUS。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為對照組（Con）、模型（DOX）組、D-核糖低劑量組（LDR）、D-核糖高劑量組（HDR），每組10 只。Con組、DOX 組灌胃給予生理鹽水（10 mL/kg），D-核糖低劑量組灌胃給予D-核糖（0.9 g/kg，10 mL/kg），D-核糖高劑量組灌胃給予D-核糖（1.8 g/kg，10 mL/kg），均連續(xù)給藥7 d。D-核糖的劑量選擇參考袁保輝等[5]的方法。在第8 d 灌胃結束后30 min，除對照組腹腔注射生理鹽水（5 mL/kg,下同）外，其余各組均腹腔注射DOX（15 mg/kg），期間小鼠全部存活。DOX 注射48 h 后處死小鼠，稱體重后摘眼球取血，血液樣本在室溫下保存30 min,4000 r/min 離心15 min，獲得用于生化分析的血清，并保存于?80 ℃冰箱備用。同時收集心臟組織并稱重，計算心臟指數(shù)。部分心臟用于組織病理檢測，部分置于?80 ℃保存，以便進行后續(xù)分析。

心臟指數(shù)（mg/g）=心臟重量（mg）/體重（g）

1.2.2 血清生化指標檢測 小鼠在給予DOX 處理48 h 后，摘眼球取血，分離血清并保存于?80 ℃冰箱備用。按照LDH 測定試劑盒說明書測定血清中LDH 水平。

1.2.3 心臟組織蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin stain，HE）染色 參考文獻[14]方法將心臟組織收集后置于4%多聚甲醛液中固定，48 h 后脫水、透明、浸石蠟，包埋，切片，進行HE 染色，脫水封片后顯微鏡觀察心肌組織病理學變化。

1.2.4 心臟組織ATP 含量測定 稱取心臟組織，用ATP 檢測裂解液勻漿，制備10%組織勻漿。在4 ℃以12000 g 離心5 min，收集上清液，通過BCA 蛋白質測定試劑盒測定每個樣品的蛋白質濃度。按照ATP 檢測試劑盒說明書測定心臟組織ATP 含量。

1.2.5 心臟氧化應激水平分析 稱取心臟組織，用預冷的生理鹽水勻漿，制備10%組織勻漿。在4 ℃以2500 r/min 離心10 min，收集上清液，通過BCA 蛋白質測定試劑盒測定每個樣品的蛋白質濃度。嚴格按照試劑盒說明書，測定心臟組織內T-SOD、CAT 活力和MDA 含量。

1.2.6 Western blot 檢測相關蛋白表達水平 用總蛋白提取試劑盒提取心臟組織總蛋白，并用BCA 法測定樣品蛋白濃度。隨后，取等量蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），使用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別使用抗Sirt1、PGC-1α、Bax、Bcl-2、Caspase-3、GAPDH 抗體4 ℃孵育過夜；洗膜緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗膜后加入相應的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）二抗，室溫孵育2 h，采用ECL 化學發(fā)光法進行顯影。使用Image J 軟件對蛋白表達水平進行定量分析，并將GAPDH 作為內參蛋白進行量化。

1.2.7 免疫組織化學法檢測Caspase-3 表達水平組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，檸檬酸緩沖液抗原修復，3%的雙氧水處理阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，加入兔源性Caspase-3 一抗4 ℃孵育過夜，次日加入山羊抗兔二抗室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺（3,3 N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，DAB）顯色，蘇木素復染細胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察拍照。每只鼠選取3 張切片，應用Image J 軟件進行定量分析，取切片中陽性染色的面積占總面積的百分比作為Caspase-3 相對表達量進行統(tǒng)計作圖[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，采用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計分析并作圖，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s 檢驗。其中，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重變化及心臟指數(shù)

由表1 可知，各組小鼠在進行DOX 和D-核糖處理前體重并無明顯差異，而在進行DOX 處理48 h后，DOX 組小鼠的體重較Con 組小鼠顯著降低（P＜0.05）。推測DOX 處理后小鼠體重顯著下降可能主要與小鼠攝食量下降有關。雖然D-核糖處理組小鼠體重高于DOX 組，但并無顯著差異（P＞0.05）。同時，各組小鼠處理后心臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05），這可能與小鼠心臟質量變小，同時體質量下降有關。

表1 各組小鼠干預前后體質量變化及心臟指數(shù)比較Table 1 Comparison of body weight and heart index of each group before and after treatment

2.2 D-核糖對DOX 介導血清LDH 水平的影響

LDH 是常見心肌酶之一，在心肌受到損傷時，LDH 從受損的心肌細胞膜滲漏到血液中，是心臟毒性的標志酶之一[16]。如圖1 所示，與Con 組比較，DOX 組小鼠血清中LDH 活性顯著升高（P＜0.05），表明DOX 組小鼠心肌組織損傷嚴重，DOX 誘導心臟毒性造模成功；D-核糖各處理組LDH 活性降低，且隨D-核糖劑量的增加而下降，HDR 組與DOX 組具有顯著性差異（P＜0.05）。這與劉平懷等[10]研究發(fā)現(xiàn)的D-核糖可以降低缺血性心肌梗塞大鼠模型LDH 活性，改善心功能的結果一致。

圖1 小鼠血清LDH 水平Fig.1 Contents of LDH in serum

2.3 D-核糖對DOX 介導心臟組織病理學的影響

組織病理學研究發(fā)現(xiàn)，DOX 可以導致心肌細胞發(fā)生空泡變性、心肌間隙增寬等病理改變[14,17]。如圖2 所示，Con 組心肌細胞結構完整，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，無明顯組織病理學損傷。DOX 組心肌細胞內出現(xiàn)空泡變性，心肌細胞間隙明顯增寬，表明模型建立成功。與DOX 組相比，LDR 組沒有明顯變化，HDR 組心肌細胞內可見空泡變性、心肌細胞間隙減少，心肌組織病理學損傷有明顯改善。綜上所述，D-核糖能使DOX 處理小鼠心臟組織形態(tài)趨于正?；?，具有一定心臟保護作用。

圖2 各組小鼠心臟組織切片病理學觀察（HE，100 μm）Fig.2 Pathological observation of hematoxylin-eosin stain sections of heart biopsy (HE,100 μm)

2.4 D-核糖對DOX 介導心臟ATP 水平的影響

DOX 可導致心肌細胞線粒體腫脹和電子傳遞鏈的解偶聯(lián)[18?19]，降低心肌細胞內ATP 水平（20%～50%），誘發(fā)心肌損傷[20?21]。Tang 等[22]研究表明，提高心肌組織內ATP 水平，可以顯著改善DOX 介導的心臟損傷（P＜0.05）。如圖3 所示，與Con 組比較，DOX 可顯著降低心臟組織內ATP 含量（P＜0.05）；與DOX 組比較，LDR 組ATP 含量有一定升高，但無顯著性差異（P＞0.05），而HDR 組ATP 含量顯著升高（P＜0.05）。王亞坤等[23]研究發(fā)現(xiàn)D-核糖能夠補充運動過程中消耗的ATP，對大鼠運動后心臟功能的恢復具有一定的作用。以上結果表明，D-核糖可能通過快速補充ATP，改善小鼠的心臟功能。

圖3 各組小鼠心臟組織ATP 含量比較Fig.3 Comparison of ATP content in heart tissues of mice in each group

2.5 D-核糖對DOX 介導心臟氧化應激的影響

研究表明DOX 介導的心臟毒性與氧化應激密切相關[24]。氧化應激導致脂質過氧化物增加、DNA損傷和線粒體功能障礙，引發(fā)細胞死亡[25?26]。吳文英等[27]和Zhao 等[28]研究發(fā)現(xiàn)抑制氧化應激，可以減輕DOX 心臟毒性。如圖4 所示，與Con 組比較，DOX可顯著增加心臟組織內脂質過氧化產物MDA 的含量（P＜0.05），并降低心臟組織抗氧化酶T-SOD、CAT 活力（P＜0.05）；與DOX 組比較，LDR 組MDA含量有一定下降，T-SOD、CAT 活力有一定升高，但均無顯著性差異（P＞0.05），而HDR 組MDA 含量顯著下降，T-SOD、CAT 活力顯著升高（P＜0.05）。上述結果表明，D-核糖可通過抑制DOX 介導的氧化應激損傷減輕其心臟毒性。

圖4 各組小鼠心臟組織MDA、CAT、T-SOD 水平比較Fig.4 Comparison of MDA,CAT and T-SOD in heart tissue of mice in each group

2.6 D-核糖對DOX 介導心臟凋亡相關蛋白表達的影響

研究表明細胞凋亡是DOX 心臟毒性的重要機制之一，抑制細胞凋亡能夠有效改善DOX 誘導的心臟毒性[29?30]。Bcl-2/Bax 比值降低啟動細胞凋亡，并由Caspase-3 蛋白執(zhí)行細胞凋亡。本研究中，如圖5 Western blot 結果所示，與Con 組小鼠相比，DOX 可顯著增加小鼠心肌組織內促凋亡蛋白Bax、Capsase-3的表達水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達水平（P＜0.05）；與DOX 組相比，LDR 組Bax、Capsase-3 表達水平有一定降低，Bcl-2 表達水平有一定升高，但無顯著性差異（P＞0.05）；而HDR 組Bax、Capsase-3 表達水平顯著降低，Bcl-2 表達水平顯著升高（P＜0.05）。此外，Caspase-3 免疫組織化學結果如圖5B、E 所示，與Con 組相比，DOX 組中Caspase-3 蛋白陽性表達增強（棕色）。與DOX 組比較，LDR 組Caspase-3 蛋白陽性表達無明顯變化，而HDR 組Caspase-3 蛋白陽性表達明顯降低。以上結果顯示，D-核糖對DOX 心臟損傷的保護作用可能與其抑制細胞凋亡相關。

圖5 各組小鼠心臟組織凋亡相關蛋白表達情況Fig.5 Expression of apoptosis-related proteins in heart tissues of different group of mice

2.7 D-核糖對Sirt1/PGC-1α 通路相關蛋白表達的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，激活Sirt1/PGC-1α通路，可以降低心臟氧化應激和線粒體損傷，緩解DOX 誘導的急性心臟毒性[31?33]。如圖6 所示，與Con 組相比，DOX顯著降低Sirt1、PGC-1α表達水平（P＜0.05）；與DOX組相比，LDR 組Sirt1、PGC-1α無顯著變化（P＞0.05），而HDR 組Sirt1、PGC-1α表達水平顯著升高（P＜0.05）。綜上所述，推測D-核糖可能通過激活Sirt1/PGC-1α信號通路，提高ATP 水平，改善心肌組織能量代謝；同時抑制氧化應激和細胞凋亡，進而對DOX 介導心臟毒性發(fā)揮保護作用。

圖6 各組小鼠心臟組織Sirt1/PGC-1α 通路表達情況Fig.6 Sirt1/PGC-1α pathway expression in heart tissues of different group of mice

3 討論與結論

DOX 誘導心臟毒性的機制較為復雜，尚未完全闡明，可能與細胞凋亡、氧化應激、能量代謝障礙、自噬等相關[34?35]。心臟是機體主要的耗能器官之一，線粒體是心肌能量產生和儲存的主要場所，心臟損傷時線粒體功能改變導致ATP 生成減少，ATP 水平是評價心肌損傷的標志之一[36]。本研究中，與Con 組相比，DOX 組小鼠心臟組織中ATP 水平顯著降低（P＜0.05），提示心肌損傷；與DOX 組相比，HDR 干預小鼠心臟中ATP 水平顯著升高（P＜0.05），LDR 組ATP 水平雖然表現(xiàn)出升高的趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05），表明HDR 可能通過改善線粒體能量代謝改善DOX 介導的心肌損傷。

大量研究表明，DOX 進入細胞后代謝產生過量的ROS，誘導細胞氧化應激，下調抗凋亡蛋白Bcl-2/凋亡蛋白Bax，觸發(fā)線粒體依賴的細胞凋亡，抑制細胞凋亡能夠有效改善DOX 誘導的心臟毒性[29?30]。本研究中，與Con 相比，DOX 組小鼠心臟中T-SOD、CAT 活力顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著增加（P＜0.05），提示氧化應激發(fā)生；同時，DOX 顯著上調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達（P＜0.05），下調抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，提示線粒體依賴的細胞凋亡發(fā)生。HDR 干預小鼠后，心臟中T-SOD、CAT 活力顯著升高（P＜0.05），MDA 水平顯著性降低（P＜0.05），這與之前的研究一致[3,37]。此外，與DOX 組相比，HDR干預顯著下調促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表達（P＜0.05），上調抗凋亡蛋白Bcl-2 表達，但LDR 干預對上述指標無顯著性影響（P＞0.05）。以上結果提示，D-核糖干預可能通過緩解DOX 介導的氧化應激抑制線粒體依賴的細胞凋亡，且具有一定的劑量效應。

沉默信息調節(jié)因子1（Sirt1）是一種煙酰胺腺苷二核苷酸（NAD+）依賴的轉錄調節(jié)因子參與調控氧化應激、細胞凋亡、線粒體功能等，在DOX 介導的心臟毒性中發(fā)揮重要的保護作用[38?39]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）是線粒體生物合成、氧化代謝及細胞能量穩(wěn)態(tài)的關鍵調控分子，在心臟代謝和功能發(fā)揮中起重要作用[22,29]。Liu 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，紫檀茋通過激活Sirt1/PGC-1α通路，降低心臟氧化應激和線粒體損傷，緩解DOX誘導急性心臟毒性。與前述一致，本研究發(fā)現(xiàn)DOX顯著下調Sirt1、PGC-1α的表達。與DOX 組相比，HDR 干預顯著上調Sirt1、PGC-1α的蛋白表達水平（P＜0.05），但LDR 干預對Sirt1、PGC-1α表達無顯著性影響（P＞0.05）。結果表明，HDR 可能通過激活Sirt1/PGC-1α通路調控線粒體功能（ATP 產生和抗氧化），且具有一定的劑量效應。

本研究初步探究了D-核糖對DOX 介導急性心臟毒性的保護作用。高劑量D-核糖干預可顯著提高心肌組織中ATP 含量，緩解心肌氧化應激，抑制線粒體依賴的細胞凋亡，說明改善心肌細胞線粒體功能可能是D-核糖保護DOX 介導心肌損傷的重要機制之一。進一步的機制研究揭示，D-核糖對線粒體功能的改善作用與其激活Sirt1/PGC-1α信號通路有關。然而，D 核糖干預對DOX 心臟毒性最佳保護效果的劑量值得進一步研究。本實驗結果為D-核糖在心血管疾病和腫瘤患者營養(yǎng)配方食品中的應用提供科學依據(jù)，有利于促進D-核糖在臨床營養(yǎng)領域以及我國特殊醫(yī)學用途配方食品行業(yè)的發(fā)展。