龔 頻，王佩佩, ，同美霖，龍 輝，毛跟年, ，陳福欣

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安 710054）

紅棗（Ziziphus jujubeMill.）是鼠李科棗屬植物，廣泛分布在南亞、東亞及澳大利亞等地區(qū)[1]。我國(guó)的棗屬植物品種約700 余種，主產(chǎn)于西北地區(qū)、黃河流域地區(qū)及東部地區(qū)[2]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中將紅棗列為最具有價(jià)值的“五果”之一，《神農(nóng)百草經(jīng)》中稱紅棗為上乘草藥。紅棗果實(shí)中富含維生素C、多糖[3?4]、酚酸[5]、黃酮類化合物[5?6]、三萜類化合物[6?8]、環(huán)核苷酸[9]和氨基酸等代謝物。眾多研究表明紅棗多糖是紅棗中豐富且具有藥理活性的主要成分之一[10]，現(xiàn)已報(bào)道的紅棗多糖的單糖組成包括鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和糖醛酸半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸[11]，發(fā)揮降糖、抗腫瘤[12]、胃腸保護(hù)[13?14]、免疫調(diào)節(jié)[15]及保肝[16]等藥理活性。

目前對(duì)多糖的提取多采用熱水提?。℉AE）、超聲輔助提?。║AE）[17]、酶輔助提?。‥AE）及微波輔助提?。∕AE）[18?19]等方法。超聲提取是借助超聲波的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)破壞紅棗的細(xì)胞壁，增加多糖分子的溶出速度，因其具有操作簡(jiǎn)便、提取效率穩(wěn)定、不影響成分結(jié)構(gòu)及活性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于各類植物中化合物的提取。近年來(lái)超聲輔助提取方式被廣泛應(yīng)用于紅棗多糖的提取，Ji 等[20]采用超聲輔助雙水相萃取（UAATPE）一步法提取大棗多糖，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化多糖得率。黎云龍等[21]通過優(yōu)化超聲波輔助提取法提取駿棗多糖，確定最佳提取條件，為后續(xù)研究提供理論參考。李棟等[22]通過比較不同提取方式對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果表明超聲輔助提取方式明顯優(yōu)于回流提取、復(fù)合酶提取等方式。Li 等[23]研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取將多糖的產(chǎn)率從6.23%提高至7.95%，而且獲得的多糖成分不被破壞。因此，超聲輔助提取具有良好的應(yīng)用前景。

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)紅棗多糖超聲輔助的條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)提取中的水浴時(shí)間、料液比、超聲時(shí)間和超聲功率進(jìn)行了考察，利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化分析。同時(shí)通過測(cè)定DPPH 自由基、羥基自由基清除能力及還原力探索紅棗多糖的抗氧化能力。此外，通過測(cè)定紅棗多糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率以考察其降糖活性，研究發(fā)現(xiàn)其降糖活性具有明顯的量效關(guān)系，而關(guān)于其降糖機(jī)制鮮有報(bào)道，因此本研究進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)（WB）探究紅棗多糖緩解胰島素抵抗引起的肝損傷的作用機(jī)制。因此，紅棗多糖可作為一種潛在藥食同源的抗氧化劑或功能性食品，為進(jìn)一步將紅棗多糖開發(fā)為抗氧化產(chǎn)品以及降糖產(chǎn)品提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滄州金絲小棗 河北滄州市；葡萄糖標(biāo)品、無(wú)水乙醇、濃硫酸、30%過氧化氫、苯酚、水楊酸、DPPH、石油醚、鐵氰化鉀溶液 深圳市文樂生物科技有限公司；三氯乙酸、氯化鐵溶液、α-葡萄糖苷酶溶液（50 U/mg）、α-淀粉酶（4 U/mg）、阿卡波糖、胰島素、葡萄糖測(cè)試試劑盒 均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；pNPG 溶液 廣州吉英生物科技有限公司；可溶性淀粉溶液、DNS 試劑 北京索萊寶科技有限公司；DMEM 深圳市益百順科技有限公司；MTT 溶液 北京雪杰特科技有限公司；顯影液 喀斯瑪廣州地化所共建倉(cāng)儲(chǔ)配送中心；HepG2 細(xì)胞株保存于本實(shí)驗(yàn)室；高糖DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶（0.25%的酶活）、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）粉末 均購(gòu)于生工生物工程有限公司；胎牛血清 購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH 抗體、抗兔IgG 二抗 購(gòu)于Santa Cruz 公司；PI3K 抑制劑LY294002 購(gòu)于碧云天生物試劑有限公司。

T2600 紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；KQ-100DE 超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；HC-150T2 高速多功能粉碎機(jī)永康市綠可食品機(jī)械有限公司；TDL-40B 電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；H-1850R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BBS-V800 超凈工作臺(tái) 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；JXFSTPRP-24 恒溫CO2培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技公司；Varioskanfiash 全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī) 上海比郎儀器制造有限公司；TS10 熒光倒置顯微鏡 尼康儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅棗多糖提取方法 將新鮮紅棗置于干燥箱中55 ℃烘干。將干燥的紅棗片粉碎得到紅棗粗粉。粗粉經(jīng)石油醚浸泡48 h，除去脂溶性物質(zhì)并通過萃取的方式去掉石油醚，然后進(jìn)行水浴60 ℃[24]超聲，經(jīng)抽濾收集濾液，濾渣加入水后再次提取，合并兩次所得濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮[25]。采用Sevag 法[26]除去蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)要步驟為將復(fù)溶于水的粗多糖溶液置容量瓶中，以三分之一體積的Sevag 試劑（氯仿:正丁醇=4:1），反復(fù)震蕩20 min，靜置，保留上層清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去剩余的氯仿、正丁醇和水，隨后加入4 倍體積95%乙醇（95%）溶液醇沉多糖，4 ℃靜置過夜。以4000 r/min 離心15 min，加入適量蒸餾水溶解沉淀后于?50 ℃真空冷凍干燥50 h 得紅棗多糖（ZJP）。

1.2.2 多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn) 稱取經(jīng)去脂處理的紅棗粗粉2 g，按上述1.2.1 方法處理。料液比1:15，超聲功率100 W，超聲時(shí)間30 min 條件下，水浴時(shí)間分別為10、20、30、40 和50 min，研究水浴時(shí)間對(duì)多糖得率的影響；水浴時(shí)間40 min，超聲功率100 W，超聲時(shí)間30 min 條件下，料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20 和1:25，研究料液比對(duì)多糖得率的影響；料液比1:15，超聲功率100 W，水浴時(shí)間40 min條件下，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40 和50 min，研究超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響；料液比1:15，水浴時(shí)間40 min，超聲時(shí)間30 min 條件下，超聲功率分別為60、70、80、90 和100 W，研究超聲功率對(duì)多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of Box-Behnken

1.2.4 紅棗多糖得率測(cè)定 采用硫酸-苯酚法[27]測(cè)定紅棗多糖含量，精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和紅棗多糖0.03 g 進(jìn)行梯度稀釋，分別向不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和紅棗多糖溶液中加入5%苯酚溶液0.30 mL 及濃硫酸3.00 mL，靜置15 min 后于490 nm 處測(cè)吸光度；然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算紅棗多糖含量，經(jīng)三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.0137x+0.0898；R2=0.9924。多糖得率的計(jì)算公式如下：

式中：c 為紅棗多糖濃度，mg/mL；F 為稀釋倍數(shù)；V 為多糖溶液的總體積（mL）；m 為取紅棗多糖質(zhì)量（mg）。

1.2.5 紅棗多糖中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定紅棗多糖中蛋白質(zhì)含量，制備不同濃度（0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μg/mL）的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL 紅棗多糖溶液，加入2.00 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液混勻，于595 nm 處測(cè)定吸光度[28]，以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.009x+0.0234；R2=0.9931，多糖溶液測(cè)得吸光度值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

1.2.6 羥基自由基清除能力測(cè)定 采用水楊酸法測(cè)定羥基自由基清除能力，取2 mL 梯度濃度紅棗多糖溶液并加入等體積等濃度（9 mmol/L）的FeSO4溶液與水楊酸-乙醇溶液，混勻后繼續(xù)加入2 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液，在37 ℃下靜置1 h 后取樣在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為Ai?？瞻捉M以蒸餾水代替多糖溶液，吸光度記為A0。對(duì)照組以蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液，吸光度記Aj，按照公式計(jì)算清除率。此實(shí)驗(yàn)以VE為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7 DPPH 自由基的清除能力測(cè)定 取梯度濃度紅棗多糖溶液2 mL 并加入2 mL 0.05 mg/mL 的DPPH 溶液，在黑暗條件下靜置30 min，于517 nm處測(cè)其吸光度Ai，以無(wú)水乙醇代替DPPH 測(cè)吸光度Aj，以蒸餾水代替多糖溶液測(cè)定A0。以VE作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式計(jì)算清除率。

1.2.8 還原力測(cè)定 采用鐵氰化鉀法測(cè)定還原力，在0.5 mL 樣品中加入2.5 mL 磷酸緩沖液（0.2 mol/mL，pH6.6）及2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴20 min 后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，靜置10 min后加入0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液進(jìn)行反應(yīng)，10 min后于700 nm 處吸光值。

1.2.9 紅棗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定 以磷酸鉀鹽緩沖溶液（0.1 mol/mL，pH7.4）配制0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，將25 μL 的α-葡萄糖苷酶溶液和40 μL 的樣品溶液進(jìn)行水浴孵化10 min，再加入50 μL 的10 mmol/L pNPG 溶液水浴孵化30 min，最后加入90 μL Na2CO3溶液，于405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度Ai，以緩沖液代替酶液測(cè)吸光度Aj，以蒸餾水代替多糖溶液測(cè)定A0。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式計(jì)算抑制率。

1.2.10 紅棗多糖對(duì)α-淀粉酶抑制率的測(cè)定 以磷酸鉀鹽緩沖溶液（0.1 mol/mL，pH7.4）配制0.2 U/mL的-淀粉酶酶溶液，將25 μL 的α-葡萄糖苷酶溶液和25 μL 的樣品溶液進(jìn)行水浴孵化10 min，再加入25 μL的2 mg/mL 可溶性淀粉溶液水浴再孵化10 min，最后加入50 μL 的DNS 試劑（3,5-二硝基水楊酸，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉），于沸水浴中反應(yīng)5 min 后冷卻至室溫，于540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度Ai，以緩沖液代替酶液測(cè)吸光度Aj，以蒸餾水代替多糖溶液測(cè)定A0。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，按照公式計(jì)算抑制率。

1.2.11 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清及100 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.12 HepG2 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 將紅棗多糖配制成高濃度水溶液，微濾膜過濾后，用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液稀釋至所需濃度待用。

首先建立HepG2 胰島素抵抗細(xì)胞模型[29?30]，將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，轉(zhuǎn)入96孔板中，每孔100 μL。待細(xì)胞單層貼壁后進(jìn)行試驗(yàn)。加入新配制的含有10?7mol/L 胰島素的培養(yǎng)液100 μL，并設(shè)無(wú)胰島素的空白對(duì)照孔。用胰島素溶液處理48 h 后分別將建模成功的細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組、胰島素抵抗模型組、二甲雙胍組（0.01 mg/mL）、紅棗多糖組（0.125、0.25、0.5、1.0 及2.0 mg/mL）。在培養(yǎng)箱孵育24 h 后，用葡萄糖試劑盒（葡萄糖氧化酶法）測(cè)定各孔培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，計(jì)算葡萄糖的消耗量。

同時(shí)進(jìn)行MTT 毒性試驗(yàn)，在葡萄糖消耗試驗(yàn)結(jié)束將待測(cè)培養(yǎng)液移出后，每孔加入150 μL DMEM及2 mg/mL MTT 溶液50 μL 作用4 h，孵育完成后，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min使藍(lán)紫色結(jié)晶溶解完全后，立即在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.13 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT 蛋白表達(dá) 將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，加入新配制的含有10?7mol/L 胰島素的培養(yǎng)液并處理48 h 后，并設(shè)無(wú)胰島素的空白對(duì)照組。分別設(shè)空白對(duì)照組、胰島素抵抗模型組、PI3K 抑制劑LY294002組（20 μmol/L）、紅棗多糖組（1 mg/mL）及抑制劑聯(lián)用紅棗多糖組。孵育24 h 后，加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白并測(cè)定蛋白濃度；將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后置于沸水浴中煮沸5 min 變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入按照1:1000 比例稀釋的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 及GAPDH 一抗工作液4 ℃孵育過夜。經(jīng)按照1:5000比例稀釋的二抗工作液室溫孵育2 h 后，以化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，所有結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析；使用GraphPadPrism8.0.2 繪圖；其中Design Expert 8.0 軟件用于響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1 所示，在水浴10～30 min 時(shí)，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率增加，水浴時(shí)間為30 min 時(shí)得率達(dá)到最大值。當(dāng)水浴40～50 min 時(shí)，得率隨時(shí)間的增加有所下降，這可能是由于其他水溶性雜質(zhì)溶出原因。故水浴時(shí)間為30 min 最佳。

圖1 水浴時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of water-bath incubation time on extraction rate of ZJP

當(dāng)料液比為1:5～1:20 時(shí)，多糖得率隨著料液比增大而增加。如圖2 所示在1:20 g/mL 時(shí)多糖得率達(dá)到最大。在料液比為1:20 后隨著料液比進(jìn)一步增大但多糖提取率未持續(xù)增加，因此選擇最佳料液比為1:20。如圖3 所示，當(dāng)超聲時(shí)間從10 min 增加到40 min時(shí)，多糖的得率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)而上升，在超聲40 min 時(shí)得率最高。然而過長(zhǎng)的超聲時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致多糖的降解和轉(zhuǎn)化，因而確定40 min 為最佳超聲時(shí)間。

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of ZJP

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of ZJP

如圖4 所示，超聲波功率為80 W 時(shí)，多糖得率最高為6.73%。然而，隨著超聲功率的進(jìn)一步增加，多糖得率下降，這可能是因?yàn)檩^高的超聲功率導(dǎo)致了多糖的降解，因此選擇80 W 作為最佳提取超聲功率。

圖4 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of ZJP

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及得率分析 通過響應(yīng)面分析對(duì)紅棗多糖提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)與優(yōu)化，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2，利用DesignExpert 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，可得到多糖得率Y 對(duì)各因素回歸方程如下所示：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

2.2.2 響應(yīng)面方差分析及響應(yīng)面圖形分析 對(duì)多糖得率的回歸模型進(jìn)行方差分析，如表3 所示，回歸模型P＜0.0001，說明該模型具有極顯著性；失擬項(xiàng)P=0.2184＞0.05，表明失擬項(xiàng)差異不顯著；決定系數(shù)R2=0.9026，說明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的一致性良好，該模型可用于多糖得率的分析和預(yù)測(cè)。通過F值可得，影響多糖得率的因素超聲時(shí)間＞超聲功率＞水浴時(shí)間＞料液比。

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

根據(jù)擬合模型繪制的多糖得率三維響應(yīng)面和等高線圖如圖5～圖10 所示。其中響應(yīng)面越陡說明影響因素較為顯著，等高線的形狀則可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。如圖9 所示，料液比和水浴時(shí)間兩個(gè)坡度相對(duì)較陡，對(duì)多糖得率的影響呈二次拋物線狀，說明料液比和水浴時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著。

圖5 超聲時(shí)間（A）和料液比（B）對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time (A) and solid-liquid ratio (B) on extraction rate of ZJP

圖6 超聲時(shí)間（A）和超聲功率（C）對(duì)多糖得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time (A) and ultrasonic power (C) on extraction rate of ZJP

圖7 超聲時(shí)間（A）和水浴時(shí)間（D）對(duì)多糖得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time (A) and water-bath incubation time (D) on extraction rate of ZJP

圖8 料液比（B）和超聲功率（C）對(duì)多糖得率的影響Fig.8 Effect of solid-liquid ratio (B) and ultrasonic power (C)on extraction rate of ZJP

圖9 料液比（B）和水浴時(shí)間（D）對(duì)多糖得率的影響Fig.9 Effect of solid-liquid ratio (B) and water-bath incubation time (D) on extraction rate of ZJP

圖10 超聲功率（C）和水浴時(shí)間（D）對(duì)多糖得率的影響Fig.10 Effect of ultrasonic power (C) and water-bath incubation time (D) on extraction rate of ZJP

利用軟件對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳理論工藝條件為超聲時(shí)間41.07 min，料液比1:20.09，超聲功率80.70 W，水浴時(shí)間30.57 min，多糖得率理論可達(dá)6.71%。為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果是否與真實(shí)情況一致，按照上述結(jié)果進(jìn)行類似驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性，將最佳工藝條件修正為超聲時(shí)間40 min，料液比1:20，超聲功率80 W，水浴時(shí)間30 min，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，多糖平均得率為6.58%，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差（2%）較小，且按上述1.2.4 方法計(jì)算得紅棗多糖總含糖量為58.88%，并根據(jù)回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量，經(jīng)計(jì)算可得蛋白質(zhì)含量為7.13%。因此該數(shù)學(xué)模型有效。

2.3 紅棗多糖體外抗氧化活性測(cè)定

如圖11 所示，隨著紅棗多糖濃度的上升，其羥基自由基清除率增大并呈明顯的劑量依賴關(guān)系。如圖12 所示，紅棗多糖DPPH 自由基清除能力隨樣品濃度的增大而增大，展現(xiàn)出良好的自由基清除能力。如圖13 所示，紅棗多糖濃度增加，其還原力同步提升，提示了其作為抗氧化劑的潛力。目前關(guān)于中藥以及藥食同源物質(zhì)中多糖提取物質(zhì)的抗氧化活性均已報(bào)道[31?32]。而多糖的抗氧化活性大多數(shù)是由于結(jié)構(gòu)中含有多羥基結(jié)構(gòu)。

圖11 紅棗多糖對(duì)羥基自由基清除能力的影響Fig.11 Effect of ZJP on hydroxyl radical scavenging

圖12 紅棗多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力的影響Fig.12 Effect of ZJP on DPPH radical scavenging

圖13 紅棗多糖對(duì)Fe3+還原力的影響Fig.13 Effect of ZJP on Fe3+ reducing power

2.4 紅棗多糖體外降糖活性測(cè)定

如圖14 所示，紅棗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶展現(xiàn)出良好的抑制活性，其抑制活性隨著多糖濃度的增加而增大，具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)紅棗多糖的濃度為14 mg/mL 時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的最高抑制率為51.56%。同時(shí)，如圖15 所示，隨著紅棗多糖濃度的增加，其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制活性也增大，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，紅棗多糖對(duì)α-淀粉酶活性的最高抑制率28.43%，對(duì)應(yīng)的濃度為4 mg/mL。

圖14 紅棗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.14 Inhibitory effects of ZJP on α-glucosidase

圖15 紅棗多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.15 Inhibitory effects of ZJP on α-amylase

2.5 紅棗多糖對(duì)胰島素抵抗的HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗和細(xì)胞活性的影響

從表4 可見，與空白組相比較，模型組的葡萄糖消耗量明顯下降，說明該模型可以用于評(píng)價(jià)紅棗多糖降糖活性。與模型組比較，二甲雙胍及紅棗多糖能促進(jìn)胰島素抵抗的HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，當(dāng)紅棗多糖給藥濃度在0.125～2.0 mg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗量隨著加藥濃度的增加而增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)加藥濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量最大，GC/MTT 平均值達(dá)到了模型組的154.2%。糖尿病的主要特征包括胰島素抵抗，肝臟細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取減少，從而造成血液中葡萄糖水平升高。本實(shí)驗(yàn)使用的HepG2 屬滿足典型胰島素受體所有要求，其中包括葡萄糖攝取、糖原合成酶的代謝等，是研究高葡萄糖消耗模型和研究胰島素抵抗的理想模型。胰島素抵抗模型試驗(yàn)中，紅棗多糖能顯著降低胰島素抵抗作用，促進(jìn)高胰島素誘發(fā)的胰島素抵抗細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取與利用。

表4 紅棗多糖對(duì)HepG2 細(xì)胞的降血糖活性Table 4 The hypoglycemic activity of ZJP on HepG2 cells

2.6 紅棗多糖對(duì)PI3K/Akt 通路的激活作用

見圖16 和表5，各組PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平變化不大，而p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平顯示，與空白對(duì)照組比較，胰島素抵抗模型組中加入PI3K抑制劑后，PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白p-PI3K 和p-AKT 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組相比，紅棗多糖組細(xì)胞中p-PI3K 和p-AKT 表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01）。LY294002 抑制劑孵育后，p-PI3K和p-AKT 蛋白表達(dá)顯著降低，而對(duì)PI3K、AKT 水平無(wú)影響，說明紅棗多糖通過上調(diào)HepG2 細(xì)胞的PI3K/Akt 通路中相關(guān)蛋白p-PI3K 和p-AKT 表達(dá)水平進(jìn)而緩解胰島素抵抗，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

表5 各組細(xì)胞中 PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of the expression levels of PI3K/Akt pathway related proteins in cells of each group

圖16 WB 檢測(cè)細(xì)胞中PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.16 Expression of PI3K/Akt pathway related proteins in cells by WB detection

3 討論與結(jié)論

多糖是紅棗中豐富且具有藥理活性的主要成分之一，對(duì)紅棗多糖的提取方法進(jìn)行優(yōu)化從而提高多糖得率具有很高的應(yīng)用價(jià)值。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)紅棗多糖超聲輔助的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳工藝條件為超聲時(shí)間40 min，料液比1:20，超聲功率80 W，水浴時(shí)間30 min，在此條件下多糖得率為6.58%。此外，通過測(cè)定DPPH 自由基、羥基自由基的清除效果以及還原力證實(shí)紅棗多糖具有良好的抗氧化活性，并且對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶最高抑制率分別為51.56%和28.43%，表現(xiàn)出降糖潛力。

肝臟是胰島素作用的主要靶器官，在葡萄糖和脂代謝過程中起重要的作用，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素糖代謝中葡萄糖輸出作用增強(qiáng)，肝糖原合成作用減弱，導(dǎo)致血糖水平升高。HepG2 滿足典型胰島素受體所有要求，是研究高葡萄糖消耗模型和研究胰島素抵抗的理想模型。許多研究證實(shí)胰島素抵抗的作用機(jī)制與抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)[33?34]，紅棗多糖是紅棗中主要的活性成分，本研究進(jìn)一步確定紅棗多糖可以上調(diào)p-PI3K、p-AKT 蛋白的表達(dá)水平，激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而改善胰島素抵抗，達(dá)到治療糖尿病的目的。

本研究證實(shí)紅棗多糖可作為一種潛在藥食同源的抗氧化劑或功能性食品，為進(jìn)一步將紅棗多糖開發(fā)為抗氧化產(chǎn)品以及降糖產(chǎn)品提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。