涂開峰

p53基因突變和p16基因缺失與肝癌的相關(guān)性研究

涂開峰

（黃岡職業(yè)技術(shù)學院 醫(yī)學部，湖北 黃岡 438002）

探討p53基因突變和p16基因缺失與肝癌的相關(guān)性。采用黃岡市中心醫(yī)院腫瘤科肝癌組織標本30例。運用飽和酚-氯仿法，提取DNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)或其他參考文獻，設計出1對p53基因外顯子8的PCR引物。進行PCR擴增，觀察目標條帶，將PCR產(chǎn)物進行純化、測序、分析。免疫組織化學方法SP-p16,對其突變和缺失進行分析。在近30名肝癌患者體檢中，有15名檢測到血漿循環(huán)核酸 p53突變。有癌轉(zhuǎn)移史的病人17例突變率大大高于癌未發(fā)轉(zhuǎn)移前13例。p53基因突變和血漿p16基因編碼缺陷都與肝癌的發(fā)生、嚴重化程度加重和癌轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)。

肝癌；基因；p53突變；p16缺失

腫瘤是一種嚴重威脅著全人類健康的疾病，隨著實驗技術(shù)和近代分子生物學理論的發(fā)展，人們對腫瘤發(fā)生機制的研究已進入到分子水平。近年來還發(fā)現(xiàn)細胞中存在抑癌基因，其功能失活,失去了對原癌基因的抑制，從而促進了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[1]。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前公認的世界上第六大最常見的惡性腫瘤，并且它在其過去近十年時間中死亡率呈上升之趨勢。手術(shù)技術(shù)的進步極大改善提高了早期肝癌患者手術(shù)的安全性和預后。然而,由于這種高自然死亡率，肝癌患者最終的預期總生存率估計仍然還是很低。研究已經(jīng)表明，肝癌早期惡性發(fā)展可能是一個多方面、多階段變化的演變過程，也是一種個人習慣性自發(fā)地激活體內(nèi)許多癌基因，使其被長期抑制后的抑癌基因和凋亡細胞的調(diào)控機制失調(diào)引起肝細胞的功能異常失活[2]。p53腫瘤細胞凋亡抑制基因位于人類染色體的17P13.1, 長約 20 KB，包含著約10個染色體內(nèi)部基因、11個染色體外部的基因和另外有5個染色體相對保守的區(qū)域。p53基因突變是多種人類惡性腫瘤中最常見的遺傳變化，其中大部分發(fā)生在保守區(qū)域的5-8外顯子上。有報道稱，許多國家的肝細胞癌（HCC）中發(fā)現(xiàn)p53基因突變[3]。綜合以上研究報道，我們認為 p53基因外顯子8的突變可能與肝癌有關(guān)，因此本研究擬驗證肝癌與p53基因外顯子8突變的關(guān)系，進一步研究p53基因相互作用在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學機制，可為肝癌患者的鑒別診斷和基因治療提供新思路，具體內(nèi)容如下:

1 資料與方法

1.1 標本采集

本課題擬采用黃岡市中心醫(yī)院腫瘤科肝癌組織標本30例。所有患者均通過腹部超聲、CT 或 MRI、CEA 和 AFP 蛋白腫瘤研究確定。本研究共納入30例肝癌患者，其中肝癌無轉(zhuǎn)移13例，肝癌并發(fā)肺、胃、腸、腦轉(zhuǎn)移17例。 男21例，女9例，年齡28～70歲，平均（49±21）歲。無論時間、飲食和治療如何，血漿都與靜脈血分離。30例正常對照為獻血員血，男20例，女10例，年齡26～56歲，平均（41±15）歲。

1.2 實驗方法

（1）根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)或參考文獻，設計1對p53基因外顯子8的PCR引物。

（2）組織DNA提取：將實驗標本研碎，用蛋白酶K進行消化，運用飽和酚-氯仿法，提取DNA。

（3）聚合酶鏈反應法(PCR擴增)方法：PCR循環(huán)條件：98℃條件預冷下變性時間為5 min，然后開始熱循環(huán)進行擴增，94℃條件下變性時間為30 s，退火后變性延續(xù)時間長約為45s，74℃條件延伸約為1 min，共計有35個擴增循環(huán)。經(jīng)加1.5%甘油的瓊脂凝膠電泳，在紫外分析儀檢測條件下均可肉眼觀察其電泳結(jié)果，拍片留存，PCR產(chǎn)物4℃保存。

（4）DNA測序PCR產(chǎn)物純化后，采用雙脫氧法，通過比較ncbi BLAST確認結(jié)果。

（5）免疫組化方法采用SPSS27.0方法，當數(shù)據(jù)比較＜0.05是為具有統(tǒng)計學差異。p16單克隆抗體及試劑由成都醫(yī)藥集團購買，當Aneniospora呈棕色和藍色時，蛋白 p16 呈陽性。對于每個部分，計算了5個高倍放大區(qū)域。細胞陽性5% ，陽性對照為同簇實驗對照。

2 結(jié)果

2.1 p53基因突變

p53基因突變和轉(zhuǎn)移癌的遺傳相關(guān)性(表1)和p53基因的突變率(表2)的分布不同。

表1 HCCp53基因突變與轉(zhuǎn)移癌的聯(lián)系[n，（%）]

表2 15例HCC患者p53基因病灶外明顯突變分布

2.2 p53 基因突變相關(guān)性分析

正常對照組30份血漿樣本檢測結(jié)果為陰性（運動無變化），30名肝病患者15份血漿樣本檢測結(jié)果為陽性（有運動變化）。30例HCC患者中，15例（15/30，50.00%）血漿基因p53發(fā)生突變，且大部分位于第8外顯子（5/15，33.33%）。 外顯子5-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移HCC組的p53型HCC的基因變化率遠高于非轉(zhuǎn)移組（P<0.0.05）。 因此，可以假設癌基因抑制突變與惡性相關(guān)事件有關(guān)（x = 65.27，P <0.05）。

2.3 p16 基因缺失

p16基因缺失程度見下表3。細胞核基質(zhì)內(nèi)棕藍色微粒檢測呈陽性，分布很均勻。根據(jù)樣本的位置，無轉(zhuǎn)移組織切片發(fā)生率高于有轉(zhuǎn)移組織切片，分別為 88.24% (15/17) 和 11.76% (2/17)。 統(tǒng)計分析顯示差異有統(tǒng)計學意義（x=6.073，P<0.01）。

表3 p16基因缺失與轉(zhuǎn)移癌的聯(lián)系[n，（%）]

3 討論

肝癌分為原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌，其中最常見的是原發(fā)性肝癌，占70%到90%之間，在我國最常見的惡性腫瘤中排名第六[4]。肝癌病人的術(shù)后5年內(nèi)生存率一般相對較低，僅約為10.1%，且由于其主要發(fā)病機制至今尚還不明確[5]，因此從分子水平研究肝癌的發(fā)病機制對肝癌患者的診斷、治療以及預后都具有重要的臨床意義。

在人類的腫瘤發(fā)生中，p53基因突變是最常見的基因水平變化。目前已有幾十個已知基因的腫瘤抑制，其中p53調(diào)控細胞生長的功能以及與腫瘤發(fā)生的密切關(guān)系，確切了解p53基因、蛋白各方面的性質(zhì)，以及p53實現(xiàn)其生物學功能的機制，有助于闡明細胞生長調(diào)節(jié)以及腫瘤發(fā)生的詳細機制。但由于體內(nèi)游離p53含量的水平低、半衰期含量低和誘導壽命長，一般試驗都未直接顯示出游離p53水平對腫瘤細胞增殖生長明顯的抑制化作用。根據(jù)上述實驗，30名患者中有15名（50.00%）p53突變。p53 突變發(fā)生在HCC患者中可能是由于染色體突變或免疫功能發(fā)生改變或染色體內(nèi)p53基因表達的嚴重缺失，可以防止細胞生長的缺失[6]。通過p53基因突變與轉(zhuǎn)移癌的遺傳相關(guān)性實驗研究的數(shù)據(jù)顯示，p53基因突變HCC陽性病例中64.71%完全發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，30.77%無出現(xiàn)任何轉(zhuǎn)移，這些試驗研究結(jié)果則均表明HCC的p53基因的突變與患者的肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。上述的許多研究均可表明，HCC p53基因突變存在確切可能性至少比一般人類已知的HCC高出得多 (P <0.05)，部分原因也認為它是由于抑癌基因的突變與惡性腫瘤事件的發(fā)生率及其惡性程度和其在臨床中惡性腫瘤的預后直接有關(guān)。人類遺傳學中p53基因突變發(fā)生形式主要為有缺失突變、點位突變、移碼突變和基因重排。突變發(fā)生的位點主要的是位于外顯因子5～8。結(jié)果顯示，15例p53基因突變序列中，第5外顯子只能占到約20.00%，第6外顯子也就是只有占到了大約20%，第7外顯子也可以占到了26.67%，第8位外顯子也才只能占到了大概33.33%。p53的基因突變的特點是錯誤突變導致蛋白質(zhì)功能發(fā)生變化，其中一些是無義的或停止突變。p53突變是原發(fā)性肝癌中最常見的突變，p53雜合等位基因缺失的頻率可以達到25％～60％。隨著技術(shù)和研究的不斷進步，致癌抑制基因檢測技術(shù)的發(fā)展，必須早期發(fā)現(xiàn)，鑒別診斷，及時干預腫瘤，這對于腫瘤患者的診治具有重要價值。

p16基因調(diào)節(jié)家族成員中（MTSI、CDR41、CDRN2）是用于調(diào)節(jié)細胞周期的基因調(diào)控家族成員中的重要組成部分。通過病例結(jié)果的分析顯示，無轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組比較差異有統(tǒng)計學意義（88.24%（15/17）、11.76%（2/17）），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。p16的主要作用是通過細胞蛋白調(diào)節(jié)S期來抑制G1期。在缺失或失活的情況下，異質(zhì)細胞酶鏈中某些酶有相對過高活性都可能進一步導致某些基因磷酸化、E2F等轉(zhuǎn)錄異常調(diào)控，從而導致了轉(zhuǎn)錄G1期功能的突然失控,細胞分子在轉(zhuǎn)錄S期突然發(fā)生的異常增殖分裂，最終導致不需要的變化[7]。因此,研究肝癌p16基因缺失的影響程度將對于探討肝癌腫瘤的基因發(fā)生、診斷、治療過程和術(shù)后修復過程至關(guān)為重要。

總之，本研究試圖通過比較對p53基因和p16基因在肝癌的發(fā)生中相互作用的生物學機制，這些機制不僅在分子水平上有明確界定，雖然還有一定的局限性，具體對應無法確定，但對臨床基因疾病診斷分型和藥物基因表達治療應用提供了初步實驗依據(jù)。

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[2]卞春安,蔣琰華,陸世民,et al.p53和p16基因過表達對人肺腺癌細胞株H1299生物學功能影響實驗研究[J].中華腫瘤防治雜志,2018, 25(5):307-314.

[3]姬媛媛,王志東,陳海燕,等.IGF-Ⅱ?qū)θ烁伟┘毎鸋epG2中抑癌基因p16和p53表達的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2017,25(12):53-58.

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On Correlation between p53 gene Mutation and p16 Gene Deletion with Liver Cancer

Tu Kaifeng

(Huanggang Polytechnic College, Huanggang 438002 Hubei)

To investigate the correlation between p53 gene mutation and p16 gene deletion and hepatocellular carcinoma.Thirty cases of liver cancer tissue samples were collected from Huanggang Central Hospital. DNA was extracted using the method of saturated phenol - chloroform. According to GenBank data or other references, a PCR primer for exon 8 of p53 gene was designed. PCR amplification was performed, the target bands were observed, and the PCR products were purified, sequenced and analyzed.In nearly 30 patients with liver cancer check-up, plasma circulating nucleic acid was detected in 15 of p53 mutations. 17 patients with a history of cancer metastasis mutation rate much higher than 13 cases before carcinoma without metastasis.Both p53 gene mutation and plasma p16 gene coding defect are associated with the occurrence, severity and metastasis of HCC.

Liver cancer; Genes; P53 mutations; Loss of p16

R735.7

A

1672-1047（2022）03-0081-03

10.3969/j.issn.1672-1047.2022.03.21

2022-05-14

湖北省教育廳科學技術(shù)研究計劃指導性項目“肝癌與p53基因外顯子8突變的相關(guān)性研究”（B2021481）。

涂開峰，男，湖北紅安人，三級主任醫(yī)師。研究方向：基礎(chǔ)醫(yī)學。

[責任編輯：曾華]