陳怡洋，孔維正，吳輝群，季菊玲

南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226000

肺癌是中國發(fā)病率和患病人數(shù)最高的腫瘤，也是癌癥死因之首。晚期肺癌患者常出現(xiàn)胸水，其中的癌細(xì)胞可通過細(xì)胞病理學(xué)來確診。然而，胸水富含蛋白質(zhì)，可使間皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增生，加上缺乏組織形態(tài)背景作為參照，導(dǎo)致胸水細(xì)胞病理學(xué)診斷的難度增加。因此，通常需要制作細(xì)胞包埋塊和免疫組化等協(xié)助診斷，成本高、時間長，在基層醫(yī)院不易施行［1］。

人工智能（artificial intelligence，AI）輔助病理診斷在臨床工作中已有一些初步應(yīng)用，但在輔助胸水肺腺癌細(xì)胞病理診斷方面鮮有報(bào)道。為獲得最優(yōu)模型，本研究采用2種較先進(jìn)的深度學(xué)習(xí)方法，即Inception V3和Yolo（You only look once）V4，并在開發(fā)數(shù)據(jù)集（訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測試集）中評估其性能［2］。應(yīng)用深度學(xué)習(xí)模型對胸水脫落肺腺癌細(xì)胞的檢測與分類，探討人工智能輔助肺癌細(xì)胞病理診斷的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性收集2019年3月至2021年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院、上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的胸水標(biāo)本130例。其中細(xì)胞病理診斷為肺腺癌110例，另有非腫瘤性胸水標(biāo)本20例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷明確，未經(jīng)臨床診療（手術(shù)、放療和化療）。本研究通過南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審批（2022-1），3家醫(yī)院均存有病理診斷知情同意書。病理圖像為脫敏處理后進(jìn)行相互公開交流學(xué)習(xí)的讀片資料，僅保留基本信息。

1.2 細(xì)胞分離、制片、染色

1.2.1 常規(guī)法處理胸水抽取胸水50 mL，加入1 000 U/mL肝素液1 mL，放鹽水瓶中置于4 ℃冰箱中靜置6～12 h，棄去上清。將底部10～20 mL富含細(xì)胞的胸水用長吸管移入2個15 mL離心管中，以1 500r/min離心后沉淀5 min；用PBS液洗1次；再以1 500r/min離心后沉淀5 min；加入液基固定液懸浮沉淀，備用。

1.2.2 單細(xì)胞分離法處理胸水抽取胸水50 mL，加入1 000 U/mL肝素液1 mL，放鹽水瓶中置于4℃冰箱中靜置6～12 h，棄去上清。將底部10～20 mL富含細(xì)胞的胸水用長吸管移入2個15 mL離心管中，以1 500r/min離心沉淀5 min；棄上清，將離心管中的細(xì)胞沉淀以5 mL“肺癌單細(xì)胞分離液”重懸，37℃消化15 min，間隔5 min搖勻1次；配制方法：0.01%PBS配制，pH 7.2，－20℃保存（表1）。用巴氏吸管將所獲細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至單細(xì)胞制備裝置，加壓通過100目篩網(wǎng)；1 500r/min離心5 min，棄上清，保留沉淀細(xì)胞；加2 mL PBS液，重懸細(xì)胞；加入液基固定液懸浮沉淀，備用。

表1 肺癌單細(xì)胞分離液配方

1.2.3 液基薄層細(xì)胞制片將上述2種方法處理的胸水，均采用膜式制片法各制片1張，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, H-E）染色［3］。

1.3 數(shù)據(jù)處理與機(jī)器學(xué)習(xí)

1.3.1 全切片數(shù)字掃描（whole slide imaging,WSI）采用40倍物鏡掃描，每個病例采集和選擇 10 幅圖像（96′96 dpi）。

1.3.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理運(yùn)算平臺為戴爾T7920圖形工作站圖形處理器（graphics processing unit, GPU）。在計(jì)算機(jī)程序中設(shè)定分組：將數(shù)據(jù)集按照6∶2∶2的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練集（n＝80）、驗(yàn)證集（n＝25）和測試集（n＝25）。訓(xùn)練集用于訓(xùn)練模型以及確定模型權(quán)重；驗(yàn)證集用于確定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及調(diào)整模型的超參數(shù)；測試集用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆夯芰?，評估模型的精確度。

1.3.3 標(biāo)注和機(jī)器學(xué)習(xí)在專科病理醫(yī)師指導(dǎo)下使用LabelImg軟件對訓(xùn)練集圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行畫框標(biāo)注，分別標(biāo)注各類細(xì)胞，定義標(biāo)簽（表2）。分別用Yolo V4和Inception V3模型進(jìn)行機(jī)器學(xué)習(xí)，對不同分類細(xì)胞進(jìn)行學(xué)習(xí)和訓(xùn)練、驗(yàn)證和測試 。

表2 圖片中各種細(xì)胞的標(biāo)記參數(shù)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析由Yolo V4和Inception V3模型內(nèi)設(shè)程序完成。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析結(jié)果（表3）顯示：130例患者中，男性49例、女性81例，年齡35～83歲，平均年齡（57±22）歲，病理診斷肺腺癌110例。130例標(biāo)本按照6∶2∶2的比例進(jìn)行預(yù)測分析并分組，其中訓(xùn)練集80例、驗(yàn)證集25例、測試集25例。

表3 3組患者的一般資料分析

2.2 細(xì)胞分離液的制片效果未經(jīng)肺癌單細(xì)胞分離液處理的病理片細(xì)胞較密集，肺腺癌細(xì)胞有很多成簇狀，單個細(xì)胞較少。如果是間皮細(xì)胞增生比較明顯，或癌細(xì)胞數(shù)量比較少的病例，病理診斷較為困難，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資?？萍?xì)胞病理醫(yī)生診斷。

結(jié)果（圖1）顯示：經(jīng)肺癌單細(xì)胞分離液處理的病理片細(xì)胞亦較密集，肺腺癌細(xì)胞仍然有少數(shù)成簇狀，但呈大串的細(xì)胞較少。同時，單個的腺癌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，病理診斷相對容易。

圖1 肺腺癌細(xì)胞的單幅顯微圖像

2.3 機(jī)器學(xué)習(xí)的數(shù)據(jù)分析常規(guī)胸水細(xì)胞片中單個細(xì)胞少，肺腺癌細(xì)胞簇內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量差異很大，單細(xì)胞和細(xì)胞簇的混合學(xué)習(xí)識別率很低，模型運(yùn)算速度較慢。其中，成簇細(xì)胞的識別率＜10%。

結(jié)果（圖2）顯示：經(jīng)肺癌單細(xì)胞分離液處理的細(xì)胞片的圖像中單個腺癌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，不僅標(biāo)注效率高，而且模型運(yùn)算速度快。使用訓(xùn)練后的Yolo V4模型對胸水脫落細(xì)胞H-E染色涂片中疑似＋確診肺癌細(xì)胞進(jìn)行識別標(biāo)注的結(jié)果：單個腺癌細(xì)胞A＋a識別準(zhǔn)確率的平均值約為20%，即全類平均正確率（mAP）為20%。

圖2 單個腺癌細(xì)胞A＋a識別準(zhǔn)確率

結(jié)果（表4）顯示：使用訓(xùn)練后的Inception V3模型對胸水脫落細(xì)胞病理圖像中單個細(xì)胞分割后的淋巴細(xì)胞、間皮細(xì)胞、疑似＋確診肺癌細(xì)胞進(jìn)行分類，腺癌（A＋a）細(xì)胞識別準(zhǔn)確度可達(dá)98%。

表4 訓(xùn)練集（train）測試結(jié)果

3 討 論

3.1 胸水中肺癌細(xì)胞的病理診斷和基于深度學(xué)習(xí)的AI模型肺癌是目前威脅人類健康常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率均為第一。肺癌的病理類型很多，其中以腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌最為常見，占所有肺癌的90%～95%。不同病理類型的肺癌不僅治療方案和預(yù)后不同，腫瘤驅(qū)動基因也有所不同。晚期肺癌常會伴發(fā)胸水，其中的癌細(xì)胞可以通過細(xì)胞病理學(xué)來明確診斷。然而，胸水中癌細(xì)胞的病理學(xué)診斷并非易事。胸水中大量增生的反應(yīng)性間皮細(xì)胞與脫落到胸水中的肺腺癌細(xì)胞形態(tài)相似，單靠顯微鏡肉眼觀察很難做出正確的診斷。因此，臨床上通過制作細(xì)胞包埋塊、加做免疫組化、DNA定量等方法來協(xié)助診斷［4］。為了不耽誤疾病的診治，快速而準(zhǔn)確地對胸水中脫落細(xì)胞做出良惡性判斷是目前對病理科醫(yī)師的迫切要求。

AI已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可以幫助病理科醫(yī)生做出更準(zhǔn)確的診斷。深度學(xué)習(xí)是AI 技術(shù)的熱門研究領(lǐng)域，是一種基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對數(shù)據(jù)進(jìn)行特征學(xué)習(xí)的AI 算法的泛稱，對于大數(shù)據(jù)樣本、復(fù)雜函數(shù)模型具有強(qiáng)大的處理能力［5］。代表性網(wǎng)絡(luò)主要是卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（convolutional neural network, CNN）。Coudray等［6］使用遷移學(xué)習(xí)和Inception V3模型對非小細(xì)胞肺癌病理圖像進(jìn)行分類，結(jié)果表明深度學(xué)習(xí)模型可以為專家和患者提供快速、準(zhǔn)確和便宜的癌癥類型或基因突變檢測，在癌癥診療方面前景可觀。目前，基于數(shù)據(jù)與模型驅(qū)動的深度學(xué)習(xí)分割方法是研究熱點(diǎn)。標(biāo)記法是將圖像欲分割成的幾個區(qū)域各以1個不同的標(biāo)號來表示，對圖像中的每一個像素，用一定的方式予以這些標(biāo)記中的某一個，標(biāo)記相同的連通像素組成該標(biāo)記所代表的區(qū)域。本課題組用此方法來標(biāo)記不同的細(xì)胞。Yolo是目前流行的目標(biāo)檢測模型之一，研究采用的是比較新的V4版本。該模型的特點(diǎn)是“快”，但每個網(wǎng)格只能預(yù)測一個物體，容易造成漏檢。除此之外，模型對物體的尺度相對敏感，尺度變化大的物體泛化能力較差。對此，本研究將病理科醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)通過其優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)化為“精準(zhǔn)識別”，但不可避免的是模型對細(xì)胞“簇”識別的精確度較低。Inception V3模型是谷歌Inception系列里面的第三代模型，相比于其他神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，Inception網(wǎng)絡(luò)最大的特點(diǎn)在于將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層與層之間的卷積運(yùn)算進(jìn)行了拓展，采用不同大小的卷積核，使得存在不同大小的感受野，最后實(shí)現(xiàn)拼接達(dá)到不同尺度特征的融合。本研究將這2種模型分別應(yīng)用在胸水脫落癌細(xì)胞病理診斷的不同任務(wù)訓(xùn)練中。

3.2 胸水單體細(xì)胞制備技術(shù)據(jù)報(bào)道［7］，目前將胸水脫落細(xì)胞的液基薄層細(xì)胞制片應(yīng)用于基于深度學(xué)習(xí)的AI細(xì)胞病理學(xué)診斷模塊開發(fā)存在1個明顯的問題：液基制片中胸水細(xì)胞成團(tuán)、成簇現(xiàn)象比較明顯，顯微鏡下不容易對焦，對病理科醫(yī)生的診斷經(jīng)驗(yàn)和水平要求較高，同時增加了機(jī)器學(xué)習(xí)難度并減慢了模塊運(yùn)算速度，不利于模塊在日常高通量病理診斷工作中的推廣應(yīng)用。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞成簇是影響AI高效迅速識別胸水肺癌細(xì)胞的最大問題。這導(dǎo)致AI診斷的樣本量、圖像標(biāo)注難度增大，工作量呈指數(shù)級增長，算法模型的精確度大幅下降。最終不僅病理診斷困難，對成像的精度和組合的影響也非常巨大。

現(xiàn)有的細(xì)胞懸液制備方法主要分為物理和化學(xué)方法。通常采用機(jī)械聯(lián)合酶消化法將實(shí)體瘤組織制備成腫瘤單細(xì)胞懸液，其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、快速，能滿足一般實(shí)驗(yàn)和臨床診斷的要求。然而此“單細(xì)胞懸液”在顯微鏡下觀察仍是以細(xì)胞簇為主的液體，并不完全滿足AI分析的需求。關(guān)鍵性病理特征采集和標(biāo)注方法的有效性決定了AI識別能力和未來診斷的精準(zhǔn)度。因此，課題組從細(xì)胞之間相互連接的機(jī)制出發(fā)，在常規(guī)細(xì)胞裂解液的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分解、離散癌細(xì)胞團(tuán)塊，研發(fā)出“癌細(xì)胞單體細(xì)胞制備方法”（已申請專利）。該方法能分離胸水中的肺癌細(xì)胞簇，形成肺癌單細(xì)胞，便于細(xì)胞標(biāo)注和機(jī)器學(xué)習(xí)，提高識別的效率和準(zhǔn)確性。

本研究發(fā)明一種應(yīng)用于AI識別的胸水單體細(xì)胞制備方法，明顯增加了胸水中肺癌細(xì)胞單體率，提高了機(jī)器學(xué)習(xí)和訓(xùn)練精準(zhǔn)識別胸水肺癌細(xì)胞的效率，化繁為簡，提升機(jī)器深度學(xué)習(xí)的泛化能力和魯棒性。不過此技術(shù)在胸水細(xì)胞AI輔助病理診斷方面還不成熟，目前缺乏多樣性數(shù)據(jù)和循證依據(jù)的支持。對此，仍需加強(qiáng)CNN與細(xì)胞良惡性特征的關(guān)聯(lián)性分析并整合專科病理醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步提高模型的精度［8］。希望在不久的未來，通過人工智能深度學(xué)習(xí)技術(shù)構(gòu)建肺癌液基細(xì)胞智能病理診斷模型的應(yīng)用，提高不同地區(qū)/單位液基細(xì)胞病理診斷的一致性，降低誤診率、漏診率。

綜上所述，AI輔助細(xì)胞病理診斷有助于提高診斷效率、縮短診斷時間、提升診斷水平，具有重要的臨床意義和廣闊的商業(yè)應(yīng)用前景。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。

致謝：南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科章建國主任、上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院病理科韓昱晨主任提供病例，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科陳崗教授提供圖片、病理診斷復(fù)核及專業(yè)指導(dǎo)。