姜文強(qiáng)，繆凌鴻,，高 亮，朱悅潔，林 艷，羅晨皓，錢琳潔，陳士友，張維娜，施大林，劉 波,，沈懷舜,，戈賢平,

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214081；2中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081；3江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無(wú)錫 214063）

0 引言

桑葉是桑樹(shù)的主要產(chǎn)物，除了具有豐富的蛋白質(zhì)含量(14%～28%)和較高的氨基酸含量(34.7%)，還具有1-脫氧野尻霉素(DNJ)和黃酮、多酚、多糖等多種具有抗氧化和殺菌消炎作用的生物活性成分[1]。近年來(lái)桑葉粉作為飼料原料在水產(chǎn)動(dòng)物上的研究逐漸增多，但桑葉粉中含有單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，并具有粗纖維含量過(guò)高的問(wèn)題。微生物發(fā)酵法能夠通過(guò)微生物產(chǎn)生的酶系將桑葉粉中的粗纖維、蛋白質(zhì)等難以消化的大分子物質(zhì)，分解為容易被機(jī)體吸收的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)自由基的清除能力以及對(duì)鐵離子等諸多物質(zhì)的還原能力[2]。桑葉粉中的單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子在發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)被微生物消解，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物的適口性[3]，提高水產(chǎn)動(dòng)物的攝食率及生長(zhǎng)性能[4-5]。有報(bào)道指出，在水產(chǎn)飼料中添加適量的發(fā)酵桑葉粉替代魚粉，不僅能夠有效改善印度囊鰓鯰(Heteropneustes fossilis)、南亞野鯪(Labeo rohita)和巴塔野鯪(Labeo bata)的生長(zhǎng)性能和飼料消化率，還可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的脂質(zhì)代謝，提高抗氧化能力；但是隨著發(fā)酵桑葉粉添加量的增加，飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率會(huì)有所下降[6-8]。因此，建立適用于桑葉粉的微生物發(fā)酵工藝是提高桑葉資源利用、開(kāi)發(fā)水產(chǎn)新型飼料原料的重要手段之一。

微生物發(fā)酵工藝中，采用單菌株與混合菌株發(fā)酵桑葉粉均能夠提高其粗蛋白含量，且不同種菌株對(duì)于桑葉粉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高與降解的作用各有不同[3]。例如，霉菌能夠更好地提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量，芽孢桿菌和霉菌對(duì)桑葉粉中的粗纖維具有較優(yōu)的處理效果，乳酸菌和酵母菌能夠更好地提高發(fā)酵桑葉粉中粗脂肪的含量[9]。此外，發(fā)酵工藝對(duì)桑葉粉品質(zhì)的改變也有重要影響。針對(duì)發(fā)酵菌株建立適用的發(fā)酵工藝，可以大大提高發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)。任元元等[3]研究發(fā)現(xiàn)，以枯草芽孢桿菌、米曲霉菌、釀酒酵母菌、植物乳桿菌等為發(fā)酵菌種，篩選、優(yōu)化桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵工藝后，發(fā)酵桑葉粉可溶性蛋白含量可以提高176.52%，氨基態(tài)氮可以提高546.34%。梁貴秋等[10]采用優(yōu)化的試驗(yàn)條件，以冠突散囊菌E6固態(tài)發(fā)酵桑葉茶6天后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量、氨基酸含量以及抗氧化能力均高于對(duì)照組。亦有研究表明，經(jīng)過(guò)酵母菌和芽孢桿菌混合菌種[11]或者是混合霉菌[12]發(fā)酵桑葉粉后，發(fā)酵產(chǎn)物中1-脫氧野尻霉素(DNJ)的含量均有所提高。因此，優(yōu)化桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵工藝，對(duì)促進(jìn)其在水產(chǎn)飼料領(lǐng)域中的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

本試驗(yàn)旨在通過(guò)響應(yīng)面方法(response surface methodology，RSM)中Box-Behnken多因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)漳州芽孢桿菌(Bacillus zhangzhouensis)液體發(fā)酵桑葉粉的料水比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和裝液量等參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，借助Design-ExpertV8.0.6綜合分析確定漳州芽孢桿菌發(fā)酵桑葉粉的最佳工藝條件，并通過(guò)分析比較桑葉粉發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量、抗氧化活性，以期為發(fā)酵桑葉粉作為水產(chǎn)植物性飼料原料提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 菌種JSSW-BP44，由江蘇省蘇微微生物研究有限公司分離保存，經(jīng)鑒定分類命名為漳州芽孢桿菌(Bacillus zhangzhouensis)，保藏編號(hào)為CCTCC No.2019989，保藏日期為2019年12月2日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為武漢大學(xué)。試驗(yàn)于2018年7月—2020年9月在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心進(jìn)行。

1.1.2 桑葉粉 取新鮮桑葉粉（粗蛋白含量為14.029%）于60～65℃烘干至恒重，以2200 r/min的轉(zhuǎn)速粉碎桑葉4 min，經(jīng)60目過(guò)篩，獲得桑葉粉。

1.1.3 發(fā)酵桑葉粉 按照10%的濃度制備桑葉漿，調(diào)整其酸堿度為pH 7～8。將已裝罐的桑葉培養(yǎng)基在121℃條件下滅菌30 min，然后冷卻至室溫，備用（圖1）。將漳州芽孢桿菌JSSW-BP44的種子菌懸液接入裝有桑葉漿的發(fā)酵罐（Biotech-5JG，保興，中國(guó)上海）中，對(duì)照組接入等量無(wú)菌蒸餾水，再以180 r/min恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵后的樣品，在無(wú)菌條件下倒入一次性無(wú)菌平板中，于-80℃冷凍后置于冷凍干燥機(jī)中干燥（Btp-9ele0x，Sp Scientific，美國(guó)）。

圖1 發(fā)酵桑葉粉制備流程

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液態(tài)發(fā)酵桑葉粉工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn) 按照1.1.3的工藝流程制備發(fā)酵桑葉粉，以粗蛋白含量為響應(yīng)指標(biāo)。采用單因素輪換法依次考查料水比(7.5%、10%、12.5%)、發(fā)酵時(shí)間(24、48、72 h)、發(fā)酵溫度(30、35、40℃)、裝液量(10%、20%、30%)對(duì)發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響[13]。發(fā)酵初始條件為料水比10%、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度35℃、裝液量20%、接菌濃度107cfu/mL。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵桑葉粉工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]，以料水比(A)、裝液量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)、發(fā)酵溫度(D)4個(gè)因素為自變量進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化漳州芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵桑葉粉的工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定 粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)。小肽含量的測(cè)定參考Enari等[15]的方法采用雙縮脲法進(jìn)行，通過(guò)式(1)進(jìn)行計(jì)算。

其中，X為樣品的吸光度值，Y為小肽含量。樣品中肽分子量分布的測(cè)定參考武萬(wàn)興等[16]的方法。樣品中氨基酸的組成及含量的測(cè)定參考姜曼等[17]的方法。

1.3.2 抗氧化活性及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測(cè)定 類黃酮、總酚含量均采用北京索萊寶科技有限公司所售試劑盒（試劑盒編號(hào)BC1335、BC1345）的測(cè)定方法測(cè)定。DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力采用北京艾普希隆生物科技有限公司所售試劑盒（試劑盒編號(hào)G0128W、QZQ-2-G）的測(cè)定方法測(cè)定。總抗氧化能力(T-AOC)、抑制超氧陰離子自由基、超氧化物歧化酶(SOD)均采用南京建成生物工程研究所所售試劑盒（試劑盒編號(hào)A015-1-1、A052-1-1、A001-4-1）的測(cè)定方法測(cè)定。單寧含量采用北京索萊寶科技有限公司所售試劑盒（試劑盒編號(hào)BC1395）的測(cè)定方法測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

文中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，所獲得的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Origin Pro 9.0軟件作圖。發(fā)酵前后桑葉粉品質(zhì)數(shù)據(jù)運(yùn)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析進(jìn)行顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比、裝液量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響

由圖2A可知，料水比為10%時(shí)，發(fā)酵桑葉粉粗蛋白質(zhì)含量最高(17.78%)，顯著高于12.5%料水比組(P＜0.05)。裝液量對(duì)發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響不顯著(P＞0.05)（圖2B）。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量最高；顯著高于72 h發(fā)酵時(shí)間組(P＜0.05)（圖2C）。發(fā)酵溫度為35℃時(shí)，發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量最高，顯著高于其余2個(gè)試驗(yàn)組(P＜0.05)（圖2D）。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果獲得漳州芽孢桿菌發(fā)酵桑葉粉的最佳單因素，即料水比10%、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度35℃、裝液量20%，以此作為響應(yīng)面初始條件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相關(guān)的優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 料水比、裝液量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型的建立及顯著性分析 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以漳州芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，粗蛋白含量為響應(yīng)值，將對(duì)發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量影響顯著的4個(gè)因素料水比(A)、裝液量(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)、發(fā)酵溫度(D)作為考察因素，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

運(yùn)用Design expert V8.0.6軟件對(duì)表2中得分進(jìn)行擬合得回歸方程，如式(2)。

對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表3可知，所建立模型的P＜0.05，顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表明模型具有較高可靠性，建模成功。經(jīng)方差分析，4個(gè)因素對(duì)于發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量影響的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即料水比＞裝液量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。其中一次項(xiàng)、交互項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著(P＞0.05)，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果影響顯著極顯著(P＜0.01)，B2對(duì)結(jié)果影響顯著(P＜0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果 為了更系統(tǒng)地分析各因素對(duì)于發(fā)酵桑葉粉粗蛋白質(zhì)含量的影響，使用響應(yīng)面法分析各個(gè)因素間的交互作用對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，高度越高等高線密度越大，兩因素交互作用越顯著，相互影響也較大。由圖3可知，料水比、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度間的交互作用均出現(xiàn)弧形關(guān)系，得到的響應(yīng)面結(jié)果都具有一個(gè)極大值點(diǎn)，并且料水比、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度間的兩兩相互反應(yīng)等高線呈橢圓形，對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響較為顯著。

圖3 各因素交互作用對(duì)發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量影響的響應(yīng)面及等高線

利用Design-Expert軟件對(duì)所得的回歸方程進(jìn)行最優(yōu)條件分析，得出漳州芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵桑葉粉的最優(yōu)條件為料水比5.82%、裝液量11.69%、發(fā)酵時(shí)間60.89 h、發(fā)酵溫度33.73℃，在此條件下發(fā)酵液粗蛋白含量為17.814%。為便于實(shí)際操作，調(diào)整條件為料水比5.8%、裝液量11.7%、發(fā)酵時(shí)間61 h、發(fā)酵溫度34℃。在此條件下做3組平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，所得產(chǎn)物粗蛋白含量的平均值為17.456%，相對(duì)偏差為0.022%，產(chǎn)物的粗蛋白含量與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為2.01%，預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度較高，說(shuō)明此模型可靠。

2.3 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉肽分子量的分布比較

由圖4可知，桑葉粉中桑葉蛋白主要由蛋白分子量＜1000 Da的小分子蛋白質(zhì)構(gòu)成，含量達(dá)97.62%。經(jīng)過(guò)漳州芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵桑葉粉蛋白分子量＜1000 Da的蛋白質(zhì)含量為97.4%。發(fā)酵后產(chǎn)物中180～3000 Da的蛋白質(zhì)含量極顯著高于發(fā)酵前(P＜0.01)，而＜180 Da的蛋白質(zhì)含量極顯著低于發(fā)酵前(P＜0.01)。

圖4 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉肽分子量的分布比較

2.4 發(fā)酵前后桑葉粉營(yíng)養(yǎng)成分和氨基酸組成的比較

由表4可知，桑葉粉在料水比為5.8%、裝液量為11.7%、發(fā)酵時(shí)間為61 h、發(fā)酵溫度為34℃的優(yōu)化試驗(yàn)條件下，經(jīng)由漳州芽孢桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵桑葉粉的粗蛋白含量由14.029%顯著提高到17.456%(P＜0.05)，粗脂肪含量較未發(fā)酵之前顯著提高147.3%(P＜0.01)；發(fā)酵產(chǎn)物中灰分和總能的含量較桑葉粉無(wú)顯著提高。桑葉粉和發(fā)酵桑葉粉共檢測(cè)到17種水解氨基酸，發(fā)酵桑葉粉氨基酸總量和必需氨基酸含量分別為11.26%和5.24%，均顯著高于桑葉原粉(P＜0.05)，其中必需氨基酸蘇氨酸(P＜0.05)、苯丙氨酸(P＜0.01)和非必需氨基酸絲氨酸(P＜0.05)、甘氨酸(P＜0.05)、丙氨酸(P＜0.01)的含量經(jīng)過(guò)發(fā)酵之后顯著提高。

表4 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉營(yíng)養(yǎng)成分和氨基酸組成

2.5 發(fā)酵前后桑葉粉品質(zhì)的比較

由表5可知，優(yōu)化條件下液態(tài)發(fā)酵所得桑葉粉的小肽含量為235.46 mg/g，較發(fā)酵前顯著提高21.63%(P＜0.01)。發(fā)酵桑葉粉中單寧、類黃酮和總酚含量分別顯著降低34.70%(P＜0.01)、13.87%(P＜0.05)和8.99%(P＜0.01)，且總抗氧化能力(P＜0.01)、抗超氧陰離子活力(P＜0.01)、超氧化物歧化酶活力(P＜0.01)和DPPH自由基清除率(P＜0.05)均顯著提高。發(fā)酵桑葉粉對(duì)羥自由基的清除率較發(fā)酵之前提高14.49%(P＞0.05)。

表5 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉品質(zhì)的比較

3 討論

3.1 液態(tài)發(fā)酵對(duì)桑葉粉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

提高植物蛋白源粗蛋白含量的方法通常有超聲波提取法、浸提法、酶解法和微生物發(fā)酵法等。微生物發(fā)酵植葉產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪含量均能夠得到不同幅度的提高，這與發(fā)酵菌種、培養(yǎng)基組成以及發(fā)酵條件有關(guān)。例如，采用不同復(fù)合菌株發(fā)酵花生莖葉，其發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量可提高25.28%或50.22%[18-19]，用釀酒酵母菌或植物乳桿菌分別發(fā)酵青蒿葉和青蒿葉渣，其發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量可分別提高43.05%和85.30%，粗脂肪含量分別提高106%和87.73%[20]。湯小朋等[21]在用黑曲霉菌固態(tài)發(fā)酵木薯渣后發(fā)現(xiàn)，粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%。本試驗(yàn)中，由漳州芽孢桿菌在優(yōu)化的發(fā)酵條件下所制得的發(fā)酵桑葉粉粗蛋白和粗脂肪含量均得到顯著提高，說(shuō)明由響應(yīng)面模型評(píng)估所獲得漳州芽孢桿菌的發(fā)酵條件適宜桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中菌體蛋白的大量分泌，使得發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白和粗脂肪的含量得到提高[20]。并且相較于其他方法，微生物發(fā)酵法能夠分解原料中的大分子物質(zhì)，產(chǎn)生更多易于消化吸收的小分子物質(zhì)，諸如多肽、游離氨基酸等[22]。微生物發(fā)酵過(guò)程中還可以產(chǎn)生有機(jī)酸、益生元和芳香味物質(zhì)，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，增強(qiáng)抗氧化能力，提高原料適口性，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[23]。微生物發(fā)酵法在銀杏葉、辣木葉以及香蕉莖葉等飼料原料中的應(yīng)用多有報(bào)道，且大多為多菌種的混合發(fā)酵[24-26]。本試驗(yàn)以漳州芽孢桿菌作為單一發(fā)酵微生物，利用其分泌的脂酶、蛋白酶、纖維素酶等將桑葉粉中難以消化的大分子蛋白分解為小肽（低聚肽，分子量180～1000 Da）和游離氨基酸（分子量＜180 Da），從而提高動(dòng)物對(duì)發(fā)酵桑葉粉的消化利用[27-29]。相較于游離氨基酸，小肽能夠直接被腸道消化，不增加腸道負(fù)擔(dān)，不消耗機(jī)體的能量；并且能夠作為載體將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微量元素輸送到機(jī)體的各個(gè)部位；且在抗氧化、降糖降脂等方面的生物活性高于大分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸[30-32]。本試驗(yàn)獲得的發(fā)酵桑葉粉中小肽含量顯著增加，說(shuō)明桑葉原粉中的大分子蛋白在漳州芽孢桿菌的作用下可有效分解為小肽，進(jìn)而被分解為游離氨基酸[33-35]。而到了發(fā)酵中后期，培養(yǎng)基中的漳州芽孢桿菌大量繁殖，游離氨基酸居于培養(yǎng)基中可利用氮源的首位[17]，可能導(dǎo)致發(fā)酵桑葉粉中游離氨基酸（肽分子量＜180 Da）所占比例低于桑葉粉。

原料氨基酸的配比和含量的高低是評(píng)價(jià)其蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。棉粕經(jīng)復(fù)合芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵6天后，其產(chǎn)物中總游離氨基酸含量可提高9.98%[36]。米曲霉菌固態(tài)發(fā)酵大麥、少孢根霉菌固態(tài)發(fā)酵玉米和高粱所得的3種發(fā)酵產(chǎn)物的總氨基酸含量可分別增加1.71%、5.11%、2.44%[37]。豆粕經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵72 h后，總氨基酸含量可提高8.35%[38]。在氨基酸組成方面，發(fā)酵桑葉粉所測(cè)得17種氨基酸含量均高于桑葉粉，且總氨基酸和必需氨基酸含量較桑葉粉顯著提高6.71%和6.72%，說(shuō)明漳州芽孢桿菌在桑葉粉發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的蛋白酶可將桑葉粉中的大分子蛋白降解為氨基酸，從而提高發(fā)酵桑葉粉中總氨基酸和必需氨基酸的含量[39]；另一方面也證明本試驗(yàn)建立的發(fā)酵條件適用于液態(tài)發(fā)酵桑葉粉[40]。由于微生物參與了液態(tài)發(fā)酵過(guò)程，發(fā)酵桑葉粉中蘇氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸組成的變化可能歸因于原料發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝[5]。

3.2 液態(tài)發(fā)酵對(duì)桑葉粉品質(zhì)的影響

微生物發(fā)酵除可能影響發(fā)酵底物的營(yíng)養(yǎng)和氨基酸組成外，對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗氧化還原物質(zhì)的含量也有一定影響。單寧是存在于植物中的一種次生代謝產(chǎn)物，是植物性蛋白源中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其可與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)及消化酶等結(jié)合，降低生物對(duì)植物蛋白的利用率[41]。研究發(fā)現(xiàn)，朱纓花粉在經(jīng)過(guò)羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵后，其單寧含量顯著降低30.20%～48.32%[42]。菜籽餅粕經(jīng)枯草芽孢桿菌等6種菌株復(fù)合發(fā)酵5天之后，其單寧降解率最高達(dá)到36.59%[43]。本試驗(yàn)也獲得相似的結(jié)果，經(jīng)漳州芽孢桿菌發(fā)酵后的產(chǎn)物中單寧含量顯著降低34.71%，說(shuō)明漳州芽孢桿菌在優(yōu)化的發(fā)酵條件下能夠通過(guò)酶促或非酶促等多種途徑來(lái)降解植物性原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[4-5]。總酚和類黃酮均是桑葉酚類物質(zhì)中的一種，具有很好的抑菌消炎、抗氧化活性和較強(qiáng)的自由基清除率[44-45]。桑葉粉在發(fā)酵過(guò)程中酚類物質(zhì)的減少可能是發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生降解酚類物質(zhì)中不穩(wěn)定酚羥基的酶類；也有可能是發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基還原糖的含量和pH的變化等諸多因素會(huì)對(duì)其酚類物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響[46]。雖然具有抗氧化活性的總酚和類黃酮含量降低，但是在本試驗(yàn)中發(fā)酵桑葉粉的DPPH清除率、總抗氧化能力、抗超氧陰離子活力、超氧化物歧化酶活力均顯著提高。微生物在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的酶類不僅會(huì)作用于酚類物質(zhì)，也會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖類化合物產(chǎn)生影響，可能使大分子葡萄糖苷類化合物轉(zhuǎn)化為小分子苷元，使得發(fā)酵桑葉粉的抗氧化能力得到提高[47]。另外，發(fā)酵產(chǎn)物中具有抗氧化活性的物質(zhì)除了酚類物質(zhì)與多糖類化合物外，發(fā)酵底物中所含的多肽類化合物經(jīng)酶水解之后肽鍵斷裂，部分具有抗氧化效用的氨基酸殘基暴露也會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力的提高起到一定的作用[27,40]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以桑葉粉為原料，選用漳州芽孢桿菌JSSW-BP44為發(fā)酵菌種，以發(fā)酵桑葉粉的粗蛋白含量為響應(yīng)值，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定漳州芽孢桿菌發(fā)酵桑葉粉的最優(yōu)條件，分別為料水比5.8%、裝液量11.7%、發(fā)酵時(shí)間61 h、發(fā)酵溫度34℃。在優(yōu)化條件下發(fā)酵所得的產(chǎn)物粗蛋白、粗脂肪和小肽含量分別提高24.4%、147.3%和21.61%，抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧含量降低34.71%。其必需氨基酸及總氨基酸含量顯著上升。此外，發(fā)酵桑葉粉DPPH自由基、羥自由基的清除率分別達(dá)到93.26%和81.84%，較發(fā)酵之前提高10.83%和14.49%，具有更強(qiáng)的抗氧化活性。總體而言，本研究獲得的漳州芽孢桿菌發(fā)酵條件適用于桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵，通過(guò)該條件液態(tài)發(fā)酵所得的發(fā)酵桑葉粉具有更佳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、抗氧化活性以及適口性，為水產(chǎn)飼料植物型原料的開(kāi)發(fā)提供了新的思路和理論依據(jù)。