蘇之文， 吳德光， 李東泰， 吳友輝(綜述)， 于 博(審校)

骨組織是人體的重要組成部分，具有保護(hù)器官、維持電解質(zhì)平衡、自我修復(fù)的功能[1]。高能量創(chuàng)傷、軟組織缺損、骨膜剝離、感染或腫瘤切除等均可造成嚴(yán)重的骨缺損或骨折不愈合[2]。目前常見的治療有自體骨及異體骨移植、誘導(dǎo)膜技術(shù)、Ilizarov技術(shù)等[3-4]。傳統(tǒng)治療方式存在自體骨數(shù)量有限、免疫排斥、疾病傳播、感染、重建期長等問題[5-7]。骨組織工程利用工程學(xué)與生命科學(xué)的原理，通過結(jié)合生物活性分子、細(xì)胞、生物材料構(gòu)建仿生支架充當(dāng)骨替代物，修復(fù)骨缺損，是未來臨床治療骨缺損和骨折不愈合的新方法。磁性納米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)是一種新型的納米材料，除具有傳統(tǒng)納米材料的優(yōu)點(diǎn)外，還有特殊的磁響應(yīng)性及超順磁性，可受外磁場調(diào)控。磁響應(yīng)納米材料結(jié)合了MNPs與其他納米材料的特性，彌補(bǔ)了單一納米材料的不足，提升了納米材料的綜合性能，在骨組織工程中有巨大的研究空間及應(yīng)用前景。本文通過對(duì)比傳統(tǒng)納米材料，總結(jié)了MNPs的優(yōu)點(diǎn)、制備方法及分類，就磁響應(yīng)納米材料在骨組織工程中的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展前景作一綜述。

1 磁響應(yīng)納米材料的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用現(xiàn)狀

組織工程概念的提出為臨界尺寸的骨缺損修復(fù)提供了新的思路與方法。骨缺損超出臨界范圍時(shí)，骨缺損常難以自我愈合。生物支架材料的植入不僅為骨缺損提供力學(xué)支撐，還能引導(dǎo)骨組織再生。雖然傳統(tǒng)的納米材料具有良好的機(jī)械性能，能夠促進(jìn)骨組織及周圍骨生長最終降解并被新生骨取代，但是會(huì)損傷細(xì)胞黏附、增強(qiáng)細(xì)胞毒性。磁響應(yīng)納米材料是由MNPs與其他納米材料復(fù)合而成，受電磁場影響，已被廣泛應(yīng)用于骨組織工程、藥物及基因傳遞、磁共振成像、磁熱療、生物傳感器、組織修復(fù)等多個(gè)領(lǐng)域[8-13]。

1.1體積小，表面易于修飾，可有效結(jié)合細(xì)胞及化學(xué)分子等物質(zhì) 磁響應(yīng)納米材料具有體積小、比表面積大、化學(xué)物理狀態(tài)不穩(wěn)定、易氧化團(tuán)聚、攝取效率低、無法有效標(biāo)記細(xì)胞等特點(diǎn)。Shelat等[14]利用精氨酸和組氨酸共同修飾Fe3O4納米粒，并發(fā)現(xiàn)其毒性最小、攝取率較高且能進(jìn)行體外MRI成像。因此，通過表面修飾來提高M(jìn)NPs穩(wěn)定性和攝取率也是目前較為常見的改性方法。

1.2具有超順磁性，可被外界電磁場調(diào)控，成像信號(hào)強(qiáng) 與傳統(tǒng)納米材料相比，MNPs在沒有外磁場時(shí)，不會(huì)表現(xiàn)出磁性；當(dāng)外磁場存在時(shí)，容易磁化，感生出與磁場同方向的磁化強(qiáng)度；當(dāng)去除外磁場時(shí)，磁性很快就會(huì)消失。Gervits等[15]證明氧化鐵納米粒是有效的磁共振造影劑，并探究不同表面修飾的氧化鐵納米粒的磁性差異。

2 MNPs的制備

不同的MNPs制備方法、條件等可以調(diào)控其理化性質(zhì)，較為精確地控制復(fù)雜的納米結(jié)構(gòu)，提高制備的精度和可重復(fù)性。目前較為常見的MNPs制備方法主要為共沉淀法、水熱合成法、溶劑熱法、溶膠-凝膠合成法、多元醇溶劑法和熱解法等。Rasouli等[16]通過水熱合成法制備具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4/金納米粒用于藥物遞送。Marycz等[17]利用溶膠-凝膠合成法成功制備具有抗炎、成骨等作用的α-Fe2O3/γ-Fe2O3納米粒子。不同的制備方法特點(diǎn)各異，根據(jù)設(shè)計(jì)選擇合適的制備方法，不斷地改進(jìn)和完善，調(diào)控MNPs的理化性質(zhì)，體現(xiàn)不一樣的效果，豐富其在骨組織工程中的應(yīng)用。

3 磁響應(yīng)納米材料分類

根據(jù)選擇基底不同，磁響應(yīng)納米材料的基底主要有金屬、陶瓷及聚合物。金屬或合金納米顆粒具有獨(dú)特的物理化學(xué)性能，除了鐵外，常用的還有金、銀、鈦、鈷鉻合金等。Ansari等[18]成功合成具有良好的細(xì)胞相容性、體外降解性、抑菌活性及礦化能力的超順磁性納米結(jié)構(gòu)的CuZnMg混合尖晶石鐵氧體。陶瓷材料中金屬氧化物、磷酸鈣和玻璃陶瓷較為常見，而聚合物是由重復(fù)的結(jié)構(gòu)連接而成的高分子量化合物，加入MNPs可讓陶瓷、聚合物具有磁響應(yīng)性能。Cojocaru等[19]采用共沉淀法制備具有良好生物相容性的以聚合物、磷酸鈣、MNPs為基礎(chǔ)的磁響應(yīng)納米復(fù)合材料。材料基底的選擇沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通過不斷改進(jìn)，改善MNPs的穩(wěn)定性、分散程度及理化性質(zhì)等，最終提高細(xì)胞生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖與成骨分化能力。

4 磁響應(yīng)納米材料在骨組織工程中的應(yīng)用

4.1磁響應(yīng)納米材料的生物安全性 有研究表明，生物材料的理化性質(zhì)如大小、形狀、純度及表面電荷等對(duì)生物安全性起重要作用。Rafieepour等[20]通過對(duì)比磁性氧化鐵微粒(>5 μm)與磁性氧化鐵納米粒(<100 nm)發(fā)現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞吞噬，但比微粒具有更大的毒性。低濃度時(shí)，MNPs經(jīng)過正常代謝途徑從體內(nèi)排出，當(dāng)納米粒濃度暴露>50 μg/ml和時(shí)間>24 h時(shí)，細(xì)胞活性降低，活性氧增加，細(xì)胞膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前，MNPs表面易于修飾，其制備工藝成熟，且理化性質(zhì)易于調(diào)控，因此在其應(yīng)用過程中，大大降低細(xì)胞毒性。Zhang等[21]利用氧化石墨烯修飾Fe3O4納米粒，發(fā)現(xiàn)其能降低活性氧含量，提高干細(xì)胞活性。然而經(jīng)過表面修飾后并非都能降低細(xì)胞毒性，Krlovec等[22]制備出巰基化二氧化硅包覆的Fe3O4破壞肌動(dòng)蛋白微絲和細(xì)胞骨架，降低細(xì)胞黏附水平。這表明磁響應(yīng)納米材料用作醫(yī)療時(shí)，需要徹底了解其細(xì)胞毒性及對(duì)細(xì)胞行為的影響。

4.2磁響應(yīng)納米材料與外磁場反應(yīng) 研究發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度的磁場作用于骨細(xì)胞所帶來的生物學(xué)效應(yīng)不一，500 nT的亞磁場抑制連接子蛋白43基因的表達(dá)，阻止了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[23]。16T的強(qiáng)磁場促進(jìn)骨細(xì)胞的增殖，抑制破骨細(xì)胞的生成。周延峰等[24]為探究不同頻率的電磁場對(duì)骨密度的影響，將大鼠予以90 min/d的1.8 mT正弦交變電磁場干預(yù)，發(fā)現(xiàn)15 Hz、45 Hz的電磁場能通過促進(jìn)成骨活動(dòng)相關(guān)因子的表達(dá)，顯著提升骨密度。綜上所述，通過調(diào)節(jié)磁場強(qiáng)度及頻率等特性可以促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、黏附遷移、影響細(xì)胞膜及細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)等，從而促進(jìn)骨修復(fù)，加速骨愈合。由于電磁場的參數(shù)可調(diào)，影響因素有差異，導(dǎo)致各作用的產(chǎn)生機(jī)制不同。電磁場作為一種非侵入的物理療法，與磁響應(yīng)納米材料結(jié)合，在骨組織工程中擁有更廣闊的應(yīng)用前景。

4.3磁響應(yīng)納米材料參與干細(xì)胞移植 近年來，除支架和活性分子外，干細(xì)胞因具有分化、刺激組織修復(fù)等特性，成為種子細(xì)胞。然而，骨缺損部位的不穩(wěn)定環(huán)境及干細(xì)胞移植后的存活率低等問題，導(dǎo)致干細(xì)胞應(yīng)用受限，因此需要監(jiān)測(cè)體內(nèi)干細(xì)胞移植后的排斥反應(yīng)與細(xì)胞狀態(tài)。磁粒子成像(magnetic particle imaging,MPI)是一種新興的分子成像技術(shù)，可以無創(chuàng)檢測(cè)和量化體內(nèi)鐵氧化物標(biāo)記細(xì)胞。Wang等[25]設(shè)計(jì)一種邊長為22 nm的立方氧化鐵納米粒，磁化強(qiáng)度大、矯頑力小、細(xì)胞攝取率高、具有MPI的高靈敏度和分辨率，能實(shí)時(shí)、長期監(jiān)測(cè)移植后的干細(xì)胞。Nejadnik等[26]利用MPI成功檢測(cè)并定量體內(nèi)的氧化鐵納米粒標(biāo)記的干細(xì)胞。綜上所述，磁響應(yīng)納米材料作為干細(xì)胞移植后的監(jiān)測(cè)工具，通過不斷改進(jìn)，為臨床應(yīng)用提供新的預(yù)測(cè)。

4.4磁響應(yīng)納米材料遞送成骨活性分子 將載藥MNPs預(yù)加載到支架上，通過磁場控制MNPs實(shí)現(xiàn)藥物的靶向傳遞與控釋，同時(shí)提高藥物療效并延長作用時(shí)間，降低全身毒性。此外可通過對(duì)磁響應(yīng)納米材料的修飾及分子結(jié)合，提高其生物相容性及特定靶點(diǎn)。Li等[27]成功制備負(fù)載姜黃素、超順磁性氧化鐵納米粒的唑來膦酸固定的聚乳酸-乙醇酸納米粒，具有骨和磁雙靶向，抑制核因子-κB信號(hào)通路的激活，阻止破骨細(xì)胞形成和納米粒誘導(dǎo)的骨溶解。Guo等[28]利用阿倫磷酸鈉修飾聚乳酸-乙醇酸基底，負(fù)載雌二醇及Fe3O4納米粒，在外磁場作用下，具有骨靶向及控制釋放能力，改善骨丟失，提高骨強(qiáng)度，促進(jìn)新骨形成?？傊琈NPs是一種有效的驅(qū)動(dòng)器，外磁場是一種開關(guān)，一起以非侵入和遠(yuǎn)程方式靶向傳遞并控制藥物釋放，促進(jìn)骨形成。靶向藥物運(yùn)輸將活性分子運(yùn)輸至目的部位，不會(huì)增加健康組織中的濃度，具有定位準(zhǔn)確、毒副作用小、針對(duì)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可能成為新的治療手段。

4.5磁響應(yīng)納米材料遞送成骨相關(guān)基因 傳統(tǒng)常用的基因載體有病毒類與非病毒類載體。病毒類載體容量小、高成本，具有致癌與感染風(fēng)險(xiǎn)，而非病毒類載體具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性大、溶解性差、需改性或功能化修飾等特點(diǎn)。磁轉(zhuǎn)染是將目的基因與MNPs結(jié)合形成磁性復(fù)合物，能縮短轉(zhuǎn)染時(shí)間，提高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力，可在電磁場影響下靶向傳遞，相比病毒類載體更為安全且不會(huì)破壞細(xì)胞膜。Brett等[29]利用編碼Bcl-2基因和綠色熒光蛋白質(zhì)粒、聚β-氨基酯、聚乙烯亞胺包裹MNPs，在電磁場作用下高效轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)骨再生。Rohiwal等[30]證明聚乙烯亞胺修飾的MNPs是一種有較好前景的傳遞系統(tǒng)，能提高基因編輯的安全性和實(shí)用性。根據(jù)目前的研究，磁響應(yīng)納米材料無論作為轉(zhuǎn)染試劑還是基因載體，提高了轉(zhuǎn)染的效率及可控性。但是基因搭載的磁響應(yīng)納米材料研究更多用于體外階段，而且制備復(fù)雜，因而導(dǎo)致應(yīng)用受限。

4.6磁響應(yīng)納米材料調(diào)控免疫微環(huán)境 巨噬細(xì)胞在骨組織的微環(huán)境中起到了重要的調(diào)控作用。當(dāng)生物支架進(jìn)入體內(nèi)，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過Toll樣受體的識(shí)別促進(jìn)骨髓來源的巨噬細(xì)胞在早期分化為M1型巨噬細(xì)胞并分泌炎性細(xì)胞因子啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。隨后，M2型巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)過程。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)聚乙二醇包覆的超順磁性氧化鐵納米粒能通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4以濃度依賴的方式抑制脂多糖誘導(dǎo)的早期炎癥反應(yīng)。隨著時(shí)間推移，機(jī)體逐漸從非特異性免疫轉(zhuǎn)為特異性免疫，細(xì)胞間通過直接或間接接觸分泌細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子等調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)。當(dāng)組織受損部位的巨噬細(xì)胞激活，持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞融合，血管開始增生，免疫細(xì)胞的分泌不斷促使組織修復(fù)。Wang等[32]將磁性M型六角形鐵氧體納米粒植入羥基磷灰石/殼聚糖支架中，招募內(nèi)源性干細(xì)胞，摻入鑭后可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，調(diào)節(jié)宿主-支架免疫反應(yīng)，并促進(jìn)成骨分化。

4.7磁響應(yīng)納米材料促進(jìn)新生血管形成 血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖后形成的血管網(wǎng)格系統(tǒng)，能將營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)焦侨睋p部位中從而促進(jìn)骨組織愈合。細(xì)胞因子療法是促進(jìn)血管再生有效的策略，但細(xì)胞因子半衰期短且在體內(nèi)易于降解和失活。Wu等[33]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合Fe3O4納米粒及靜磁場的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)來源的新型外泌體能夠通過上調(diào)miR-1206a顯著促進(jìn)成骨和新生血管形成。此外，F(xiàn)ilippi等[34]將MNPs摻入到聚乙二醇水凝膠中，在靜磁場刺激下，促進(jìn)血管相關(guān)基因的表達(dá)、骨修復(fù)及新生血管形成。此外，有研究提出細(xì)胞片技術(shù)在多重因素的影響下對(duì)血管生成具有正向作用。Silva等[35]利用Fe3O4納米粒、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞共同構(gòu)建磁響應(yīng)細(xì)胞膜片，促進(jìn)3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)的成骨及新生血管形成。磁響應(yīng)納米材料可從本身的理化性質(zhì)、與微量元素的結(jié)合、細(xì)胞因子的負(fù)載機(jī)仿生人工骨膜等方面促進(jìn)新生血管形成，同時(shí)，由于磁響應(yīng)特性，使細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械形變對(duì)血管生成產(chǎn)生正向作用，使磁響應(yīng)材料在臨床應(yīng)用有較好的前景。

4.8磁響應(yīng)納米材料促進(jìn)骨修復(fù) 目前組織工程存在的問題主要是細(xì)胞大多數(shù)在于材料的表面，很難進(jìn)入支架中心。近年來，有觀點(diǎn)提出利用外部磁場促進(jìn)細(xì)胞遷移至三維支架的中心。Li等[36]研究Fe3O4/聚多巴胺復(fù)合納米粒，促進(jìn)細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白表達(dá)，在沒有電磁場作用下能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移。Xia等[37]將氧化鐵納米粒加入到磷酸鈣骨水泥中，觀察Wnt/β-catenin的激活，顯著促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的黏附、成骨分化和礦物合成。隨著對(duì)生物支架材料結(jié)構(gòu)的研究，為了避免細(xì)胞利用率低的問題，有研究提出基于無支架細(xì)胞膜片的技術(shù)，能保留豐富的細(xì)胞外基質(zhì)，避免細(xì)胞丟失，提高細(xì)胞利用率，形成良好的三維結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜片的制備技術(shù)豐富，由于MNPs具有良好的分離能力及超順磁性，通過MNPs制備多細(xì)胞膜片對(duì)骨組織工程中生物支架材料的研發(fā)提供了新的思路。Santos等[38]首次使用MNPs標(biāo)記的MC3T3-E1和脂肪干細(xì)胞在磁力作用下制備分層無支架的異型磁響應(yīng)細(xì)胞膜片，使用MNPs標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞制備同型磁響應(yīng)細(xì)胞膜片，發(fā)現(xiàn)21 d后在無成骨誘導(dǎo)因子的作用時(shí)也能具有較高的成骨基因水平和體外礦化能力，且異型高于同型磁響應(yīng)細(xì)胞膜片。磁響應(yīng)納米材料的生物安全性及促進(jìn)組織修復(fù)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間脈絡(luò)見表1。

表1 磁響應(yīng)納米材料的生物安全性及促進(jìn)組織修復(fù)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間脈絡(luò)表

5 結(jié)語

目前關(guān)于磁響應(yīng)納米材料與電磁場在骨組織工程中的研究眾多，但仍未找到最優(yōu)解決方案。磁響應(yīng)納米材料的制備與結(jié)構(gòu)決定了最終材料的性能及應(yīng)用。理想的生物材料需要良好的體內(nèi)降解性能，現(xiàn)階段只能通過制備時(shí)預(yù)先設(shè)定，無法根據(jù)骨愈合的實(shí)際情況決定降解速率，影響骨修復(fù)。近年來在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分多數(shù)以鼠類為主，所得的數(shù)據(jù)對(duì)于磁響應(yīng)納米材料應(yīng)用于大型動(dòng)物或者人體的參考價(jià)值不足，需要放大數(shù)倍才能感應(yīng)，可能伴隨出現(xiàn)更多的安全性問題，仍需要更長時(shí)間監(jiān)測(cè)，同時(shí)缺少電磁場及磁響應(yīng)納米材料在體內(nèi)的遠(yuǎn)期研究。如何優(yōu)化其制備，調(diào)控其降解，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)的應(yīng)用及遠(yuǎn)期監(jiān)測(cè)，這也是未來眾多學(xué)者需探索的問題。如今電磁場與磁響應(yīng)納米材料在骨組織工程中研究增多，潛在機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究和探討。磁響應(yīng)納米材料更多應(yīng)用于創(chuàng)傷、腫瘤、骨感染、骨膜剝離等原因造成的嚴(yán)重的骨缺損或骨折不愈合。除此之外，還可用于腫瘤的診斷、監(jiān)測(cè)及治療。通過直接注射或者靜脈注射將MNPs植入腫瘤部位，利用磁性產(chǎn)熱，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前磁響應(yīng)納米材料仍然處于研究當(dāng)中，尚未發(fā)現(xiàn)用于臨床。但是磁響應(yīng)納米材料的獨(dú)特性質(zhì)加速了其在骨組織工程中的應(yīng)用，為臨界尺寸的骨缺損修復(fù)提供了新的思路。