賈笑冬， 于海波， 宋海旭， 桑占發(fā)， 梅 竹， 劉 晶， 閆承慧

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.解放軍三二二九五部隊(duì) 檢驗(yàn)病理科，遼寧 遼陽(yáng) 111000

成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞失去再生能力是心臟組織發(fā)生損傷無(wú)法自我修復(fù)的根本原因，也是心肌梗死等疾病導(dǎo)致心臟衰竭甚至死亡的關(guān)鍵原因［1］。盡管有研究發(fā)現(xiàn)成年心肌存在再生潛能［2］，但在大多情況下，成熟心肌的再生能力十分有限，或處于關(guān)閉狀態(tài)，難以滿足病理情況下心肌增殖修復(fù)的需要［3］。闡明成熟心肌增殖再生功能的調(diào)控機(jī)制，有效誘導(dǎo)損傷的心臟組織通過(guò)內(nèi)源性心肌細(xì)胞增殖進(jìn)行修復(fù)，是心血管疾病研究面臨的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。有研究證實(shí)，新生24 h內(nèi)的小鼠心肌細(xì)胞仍具有良好的增殖能力［4］。然而，出生7 d后，隨著心肌細(xì)胞成熟，新生小鼠（乳鼠）心肌細(xì)胞的增殖能力就會(huì)喪失。從遺傳學(xué)角度分析，成年小鼠（成鼠）與乳鼠具有完全相同的基因組信息，因此，影響心肌細(xì)胞再生功能的調(diào)控開關(guān)應(yīng)該主要在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中［5］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）通過(guò)與關(guān)聯(lián)的微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，circRNA在病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-9］。目前，關(guān)于心肌細(xì)胞增殖能力調(diào)控相關(guān)的circRNA報(bào)道較少?；诖?，本研究應(yīng)用乳鼠和成鼠的心臟組織進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組芯片的大數(shù)據(jù)分析，旨在尋找差異表達(dá)的circRNA及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 收集新生24 h內(nèi)的雄性C57BL／6J乳 鼠和8周齡C57BL／6J雄性 成 鼠 各3只。C57BL／6J小鼠購(gòu)自集萃藥康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)可。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 心臟組織標(biāo)本收集 將小鼠麻醉，采用眼科剪打開胸腔，摘取心臟，去除心耳。應(yīng)用生理鹽水灌注沖洗后吸干水分。將標(biāo)本放置到含有2 ml Trlzol試劑的15 ml離心管中保存。

1.3 RNA提取 在TRIzol試劑中剪碎心臟組織，4℃、12 000r／min離心2 min。將勻漿混合液轉(zhuǎn)入新EP管中，加入400μl的三氯甲烷，劇烈混勻，4℃、12 000 r／min離心15 min；分離上層RNA移至新EP管中，1:1加入異丙醇，4℃、12 000 r／min離心15 min。棄上清，加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇重懸沉淀；4℃、12 000 r／min離心15 min，棄上清，加入適量DEPC水溶解RNA。Nanodrop 2000測(cè)RNA濃度，評(píng)價(jià)RNA的完整性。

1.4 芯片分析 Agilent-085631 RNA芯片及數(shù)據(jù)分析由博淼生物有限公司（Bio Miao Biotechnology Co.，Ltd.中國(guó)北京）進(jìn)行。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA，合成為cRNA并用Cyanine-3-CTP標(biāo)記后，進(jìn)行微陣列雜交，用安捷倫掃描儀G2505C（Agilent Technologies）掃描陣列。應(yīng)用功能提取軟件（10.7.1.1版，安捷倫科技公司）分析陣列圖像以獲取原始數(shù)據(jù)。使用Genespring（14.8版，Agilent Technologies）完成原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)分析。通過(guò)倍數(shù)變化以及t檢驗(yàn)計(jì)算P值。上調(diào)和下調(diào)基因的閾值設(shè)置為倍數(shù)變化≥2.0，P≤0.05。使用GO分析和KEGG分析確定差異circRNA的生物學(xué)功能?；谠撐锓N所有已知miRNA（數(shù) 據(jù) 來(lái) 源 于miRBase V22），應(yīng) 用miranda程 序［10］預(yù)測(cè)circRNA序列上可能結(jié)合的miRNA，選擇結(jié)合能量＜-20 J的已知功能miRNA進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異情況及相關(guān)性 根據(jù)芯片的探針重復(fù)分別計(jì)算質(zhì)控點(diǎn)和非質(zhì)控點(diǎn)的CV值，取對(duì)應(yīng)的中位值及表示芯片的變異系數(shù)，判斷不同樣本的檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)體系是否穩(wěn)定，一般CV值要求低于15%。本次檢測(cè)結(jié)果中平均CV值為8.16%，最大CV值為9.61%，提示基因芯片檢測(cè)成功。進(jìn)一步應(yīng)用Pearson Correlation檢驗(yàn)分析樣本間相關(guān)性和主成分，兩組樣本的分布良好，組內(nèi)CV小。見圖1。

圖1 兩組樣本的主成分分布圖

2.2 circRNA差異表達(dá)情況分析 根據(jù)分組情況對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾并根據(jù)對(duì)應(yīng)的閾值（差異倍數(shù)＞2，P＜0.05）分別進(jìn)行差異circRNA篩選，結(jié)果顯示，乳鼠circRNA表達(dá)上調(diào)38個(gè)，circRNA表達(dá)下調(diào)1個(gè)。對(duì)差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，區(qū)分兩組或多組樣本（圖2a）。應(yīng)用火山圖和散點(diǎn)圖展示差異表達(dá)circRNA的差異倍數(shù)及P值分布情況（圖2b、圖2c）。

圖2 差異表達(dá)circRNA的分布情況（a.乳鼠和成鼠circRNA差異表達(dá)的聚類分析圖；b.乳鼠和成鼠circRNA差異表達(dá)的散點(diǎn)圖；c.乳鼠和成鼠circRNA差異表達(dá)的火山圖）

2.3 差異表達(dá)circRNA的宿主基因富集分析 本研究?jī)H對(duì)差異表達(dá)上調(diào)的circRNA宿主基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析。GO富集分析顯示，上調(diào)表達(dá)的circRNA主要與蛋白激酶和RNA相關(guān)蛋白的反向激活調(diào)控有關(guān)，而這些宿主基因最主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控通路與有絲分裂調(diào)控、流體力學(xué)調(diào)控和硫基代謝調(diào)控有關(guān)（P均＜0.001）。見圖3。

圖3 GO富集分析及KEGG信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控分析（a.GO富集分析；b.KEGG分析）

2.4 差異表達(dá)circRNA的互作調(diào)控miRNA分析 根據(jù)芯片分析結(jié)果，獲取差異表達(dá)倍數(shù)＞5的circRNA共有5個(gè)，分別是上調(diào)表達(dá)的mmu-circ RNA-0001016、mmu-circRNA-0000126、mmu-circRNA-0000663、mmu-circRNA-0000914和下調(diào)表達(dá)的mmu-circRNA-0001718。見表1。

表1 差異表達(dá)circRNA及互作miRNA分析

3 討論

細(xì)胞死亡期作為急性心肌梗死的關(guān)鍵病理分期，貫穿于整個(gè)急性心肌梗死損傷修復(fù)過(guò)程［11-12］。circRNA作為一類新型的非編碼RNA，在心肌細(xì)胞增殖調(diào)控中可能發(fā)揮基礎(chǔ)性作用，有望成為急性心肌梗死后促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的潛在靶點(diǎn)。與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由外顯子序列構(gòu)成，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。功能研究發(fā)現(xiàn)，大部分circRNA分子上富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，通過(guò)解除miRNA對(duì)靶基因的抑制作用改變靶基因的表達(dá)水平，這一作用機(jī)制也被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-0001016、circRNA-0000126和circRNA-0000663對(duì)目前已知的可能參與細(xì)胞周期調(diào)控的miRNA家族成員miRNA-15、miRNA-34a和let7有相互作用，提示這些circRNA可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA方式發(fā)揮了對(duì)心肌細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。其中，mmu-circRNA-0000914涉及的與增殖有關(guān)的miRNA最多，包括既往研究報(bào)道的與心肌細(xì)胞增殖能力調(diào)控密切相關(guān)的miRNA-195和miRNA-294［14-15］。此 外，mmu-circRNA-0001718表達(dá)下調(diào)，且與心肌細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控分子miRNA-128有著明顯的相互作用，這些差異表達(dá)顯著的circRNA可能通過(guò)調(diào)控miRNA抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致各種心律失常、心肌重構(gòu)和心衰等永久性心肌損傷的發(fā)生。

綜上所述，與成鼠心肌組織比較，乳鼠存在顯著差異表達(dá)的circRNA，這些差異表達(dá)顯著的circRNA可能通過(guò)調(diào)控miRNA抑制細(xì)胞增殖。闡明并進(jìn)行關(guān)鍵circRNA的調(diào)控研究，有可能為心肌細(xì)胞增殖的干預(yù)研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。