倪炯臣 張雷雷 李思詩(shī) 張 偉

(1 陜西省商洛市商南縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，商洛市 726300，電子郵箱：1445792501@qq.com； 2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)系中西醫(yī)結(jié)合臨床，咸陽(yáng)市 712046； 3 陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，西安市 710021)

帕金森病又稱震顫麻痹，是繼阿爾茨海默病之后的第二大神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢(shì)步態(tài)障礙為主[1]。預(yù)計(jì)2040年全球帕金森病患者總數(shù)將超過(guò)1 400萬(wàn)例[2]，65歲以上人群的患病率將超過(guò)1%[3]。在我國(guó)，2005年50歲以上人群的帕金森病患病率約為1%，65歲以上人群的患病率高達(dá)1.7%[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年我國(guó)帕金森病患者已達(dá)200萬(wàn)人，隨著人口老齡化進(jìn)展加速，預(yù)計(jì)到2030年帕金森病患者數(shù)量將增加到500萬(wàn)[5]。帕金森病的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，其病理特征是黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的大量退化和進(jìn)行性缺失，這與α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)積聚、神經(jīng)免疫炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、谷氨酸的毒性作用、細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。目前，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)多巴胺能通路治療帕金森病，其中左旋多巴制劑、多巴胺受體激動(dòng)劑因?qū)?qiáng)直、震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀有顯著療效而被廣泛使用，成為治療帕金森病的主要藥物[7]，但大劑量、長(zhǎng)期服用這些藥物會(huì)出現(xiàn)癥狀波動(dòng)、運(yùn)動(dòng)障礙，甚至情感障礙加重等不良反應(yīng)，并且不能阻斷疾病進(jìn)程[8]。

帕金森病歸屬于中醫(yī)的“顫證”“震顫”等范疇。當(dāng)歸芍藥散出自張仲景所著的《金匱要略》，全方由當(dāng)歸、芍藥、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎組成。其中當(dāng)歸養(yǎng)血活血止痛，白芍養(yǎng)血柔肝、和血通脈，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，白術(shù)補(bǔ)氣健脾、燥濕利水；茯苓、澤瀉、川芎共助血分藥發(fā)揮活血利水、通經(jīng)活絡(luò)的功效。全方養(yǎng)血、柔肝、健脾并舉。當(dāng)歸芍藥散最早被日本學(xué)者牧田憲氏認(rèn)為是治療阿爾茨海默病的首選經(jīng)方，療效顯著[9]。此外，水島宣昭[10]發(fā)現(xiàn)，使用當(dāng)歸芍藥散可以改善癡呆患者的運(yùn)動(dòng)機(jī)能和智能。而葉玉紅[11]的研究也顯示，當(dāng)歸芍藥散治療可以提高老年性癡呆患者的日常生活能力和智力。

將當(dāng)歸芍藥散用于治療帕金森病已有先例。田丹楓等[12]應(yīng)用柴胡龍骨牡蠣湯合當(dāng)歸芍藥散加減治療帕金森病老年患者上半身振搖及腿腳攣急，治療半個(gè)月后患者上半身振搖明顯緩解；玉井敏弘[13]在臨床上觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用當(dāng)歸芍藥散治療帕金森病性癡呆的療效顯著，并證實(shí)當(dāng)歸芍藥散的活血化瘀作用可通過(guò)改善腦微循環(huán)、降低血液黏度，發(fā)揮治療帕金森病癡呆癥狀的作用?；诋?dāng)歸芍藥散可用于治療帕金森病的臨床基礎(chǔ)，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方從分子水平上分析當(dāng)歸芍藥散治療帕金森病的機(jī)制，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方治療帕金森病的相關(guān)靶點(diǎn)，從而進(jìn)一步探討其治療帕金森病的可行性，為中藥治療帕金森病提供理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸芍藥散活性成分及其靶點(diǎn)基因的篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(https://tcmsp-e.com/)，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢索，檢索時(shí)間為建庫(kù)至2020年6月4日。因唐末宋初將當(dāng)歸芍藥散中的芍藥分為赤芍、白芍，本研究進(jìn)行中藥成分及相應(yīng)靶點(diǎn)的查詢及篩選時(shí)，將白芍與赤芍共同納入。通過(guò)檢索并刪除重復(fù)成分，獲得當(dāng)歸芍藥散的活性成分。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步檢索活性成分作用的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)及非“Homo sapiens”類型的靶點(diǎn)，并經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(www.uniprot.org)進(jìn)行校正獲得當(dāng)歸芍藥活性成分的靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(www.genecards.org)、MalaCards數(shù)據(jù)庫(kù)(www.malacards.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(www.disgenet.org)、Therapeutic Target Database 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.db.idrblab.net/ttd/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)中，以“Parkinson′s disease”為檢索詞進(jìn)行篩選，檢索時(shí)間為建庫(kù)至2020年6月4日。去除重復(fù)并經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)校正后，獲得帕金森病相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 共同靶點(diǎn)的篩選及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用R語(yǔ)言軟件繪制韋恩圖，將活性成分靶點(diǎn)與帕金森病相關(guān)靶點(diǎn)取交集。將共同靶點(diǎn)輸入至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.string-db.org)中，設(shè)置條件為“Homo sapiens”，構(gòu)建共同靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，評(píng)分條件設(shè)定為>0.4，隱藏孤立蛋白，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件統(tǒng)計(jì)出共同靶點(diǎn)的Degree值，獲得關(guān)鍵蛋白(Degree值>30)。

1.4 共同靶點(diǎn)的功能和通路富集分析 采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.david.ncifcrf.gov)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析(包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。以“P<0.01，基因數(shù)>8”作為條件進(jìn)行篩選，得到共同靶點(diǎn)的主要生物功能及發(fā)揮作用的主要通路，并利用R 語(yǔ)言軟件繪制氣泡圖。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.1 實(shí)驗(yàn)藥物：所用中藥材均購(gòu)自西安市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，經(jīng)生藥學(xué)分析鑒定其原植物分別為當(dāng)歸、赤芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎。按原方比例(當(dāng)歸9 g、赤芍48 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉24 g、川芎24 g)水煎2次，過(guò)濾濃縮至所需濃度。

1.5.2 含藥血清的制備：雄性C57BL/6小鼠10只，8周齡，體重23～28 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(陜)2019-001]。飼養(yǎng)環(huán)境12 h光照，室溫控制在(23±1)℃，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水，適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的規(guī)定。采用隨機(jī)數(shù)字表法將10只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組與當(dāng)歸芍藥散組各5只。當(dāng)歸芍藥散組按臨床等效劑量的10倍(47 g生藥/kg體重)進(jìn)行灌胃，2次/d，共5次。于末次灌胃后1 h，采用混合濃度為3%～4%的乙醚與氧氣麻醉小鼠，無(wú)菌條件下，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血1 mL，4℃靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，分離含藥血清。將同組小鼠含藥血清混勻，56℃水浴30 min以滅活血清，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后凍存管分裝，-20℃保存?zhèn)溆肹14]。以相同條件分離空白對(duì)照組小鼠的血清。

1.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)：人源神經(jīng)母瘤細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞因具有中等水平的多巴胺β羥化酶活性，而被廣泛應(yīng)用于帕金森病的體外機(jī)制研究[5]，故本研究選擇該細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。設(shè)定培養(yǎng)條件為溫度37℃、5% CO2，培養(yǎng)基液為含10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：10100147C)的杜氏改良依格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；美國(guó)Corning公司，批號(hào)：10-017-CV)。細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 實(shí)驗(yàn)分組：(1)對(duì)照組采用空白對(duì)照組血清處理SH-SY5Y細(xì)胞，在37℃、5% CO2的條件下處理24 h。(2)當(dāng)歸芍藥散組給予當(dāng)歸芍藥散濃度為100 ng/mL的含藥血清(采用高壓過(guò)的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mg/mL，6孔板中2 mL的培養(yǎng)體積給藥劑量為4 μL)，在37℃、CO2含量為5%的條件下處理24 h。(3)1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)組，給予500 μmol/L的MPP+(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：D048；采用高壓過(guò)的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mmol/L，6孔板中2 mL的培養(yǎng)體積給藥劑量為20 μL)，在37℃、5% CO2的條件下處理24 h。(4)當(dāng)歸芍藥散+MPP+組，給予當(dāng)歸芍藥散濃度為100 ng/mL的含藥血清(采用高壓過(guò)的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mg/mL，6孔板中2 mL的培養(yǎng)體積給藥劑量為4 μL)，在37℃、5% CO2的條件下預(yù)處理24 h后，再給予500 μmol/L的MPP+(采用高壓過(guò)的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mmol/L，6孔板中2 mL的培養(yǎng)體積給藥劑量為20 μL)在37℃、5% CO2的條件下處理24 h。采用6孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每孔細(xì)胞接種量為1.0×106個(gè)。

1.5.5 Western blot檢測(cè)：分組處理后，經(jīng)4℃磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，加入1 mL RIRA裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量后，取15 μg總蛋白行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。于含2%牛血清白蛋白封閉溶液中室溫下孵育2 h。一抗包括鼠抗α-Syn(美國(guó)CST公司，批號(hào)：51510；稀釋比例1 ∶1 000)，兔抗活化型Caspase3(美國(guó)CST公司，批號(hào)：9661；稀釋比例1 ∶1 000)、兔抗活化型Caspase9(美國(guó)CST公司，批號(hào)：7237；稀釋比例1 ∶1 000)、兔抗Parkin(美國(guó)CST公司，批號(hào)：2132；稀釋比例1 ∶1 000)、兔抗PTEN誘導(dǎo)假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1；美國(guó)CST公司，批號(hào)：6946；稀釋比例1 ∶1 000)，內(nèi)參鼠抗β-actin(上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：D191048；稀釋比例1 ∶2 000)。二抗包括辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合親和純山羊抗兔IgG(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SA00001-2；稀釋比例1 ∶5 000)和辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合親和純山羊抗鼠IgG(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SA00001-1；稀釋比例1 ∶5 000)。按照說(shuō)明書，加入稀釋后的一抗，4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，然后加入二抗，繼續(xù)室溫孵育2 h。采用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行成像，經(jīng)LabImage軟件(德國(guó)Kapelan公司)進(jìn)行分析，計(jì)算各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸芍藥散的活性成分及其靶點(diǎn)、帕金森病相關(guān)靶 獲得當(dāng)歸芍藥散活性成分共83個(gè)，其中當(dāng)歸2個(gè)、白芍13個(gè)、赤芍29個(gè)、茯苓15個(gè)、白術(shù)7個(gè)、澤瀉10個(gè)、川芎7個(gè)，部分活性成分見(jiàn)表1。共獲得活性成分相應(yīng)靶點(diǎn)420個(gè)，刪除重復(fù)及非“Homo sapiens”類型的靶點(diǎn)，并經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)校正后獲得靶點(diǎn)141個(gè)。聯(lián)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并去重后共獲得帕金森病相關(guān)的靶點(diǎn)8 192個(gè)。

表1 當(dāng)歸芍藥散的部分活性成分

2.2 共同靶點(diǎn)的篩選結(jié)果以及PPI網(wǎng)絡(luò) 共獲得活性成分作用靶點(diǎn)與帕金森病相關(guān)靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)111個(gè)(見(jiàn)圖1)。 將111個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)中，結(jié)果顯示共有110個(gè)蛋白(其中IGHG1未檢索到“Homo sapiens”)發(fā)生相互作用，交聯(lián)數(shù)為1 042條(P<1.0×10-16)，見(jiàn)圖2。利用Cytoscape軟件CytoHubba插件統(tǒng)計(jì)，出現(xiàn)Degree值≥30的關(guān)鍵蛋白共19個(gè)，依次為白細(xì)胞介素(interleukin,IL)6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、Fos原癌基因AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit,FOS)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)8、Caspase3、 一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、RELA原癌基因核因子κB亞單位、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARG)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、細(xì)胞色素C，體細(xì)胞(cytochrome C，somatic，CYCS)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、缺氧誘導(dǎo)因子1 (hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)A，這些蛋白即為當(dāng)歸芍藥散治療帕金森病的關(guān)鍵蛋白，見(jiàn)圖3。

圖1 韋恩圖

圖2 共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 當(dāng)歸芍藥散治療帕金森病的關(guān)鍵蛋白

2.3 GO功能富集分析和 KEGG通路分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)設(shè)涉及的細(xì)胞組分包括細(xì)胞核、細(xì)胞連接、突觸后膜等(見(jiàn)圖4A)，主要正向調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、血管生成、細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)寡聚化等生物學(xué)過(guò)程(見(jiàn)圖4B)，負(fù)向調(diào)控蛋白結(jié)合、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、平滑肌細(xì)胞增殖、雙細(xì)胞緊密連接組件等生物學(xué)過(guò)程(見(jiàn)圖4C)，并調(diào)控膽堿能突觸傳遞、DNA模板轉(zhuǎn)錄、腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路等調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程(見(jiàn)圖4D)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)基因可以通過(guò)TNF信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等多條信號(hào)通路發(fā)揮作用(見(jiàn)圖4E、圖5)。

A 前10條細(xì)胞組分

E 前10條KEGG信號(hào)通路

圖5 共同靶點(diǎn)的KEGG-帕金森病通路分析

2.4 Western blot結(jié)果 MPP+組的PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組下降(均P<0.05)，當(dāng)歸芍藥散+MPP+組的PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平較MPP+組上升(均P<0.05)。MPP+組的α-Syn、活化型Caspase9、活化型Caspase3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組上升(均P<0.05)，當(dāng)歸芍藥散+MPP+組的α-Syn、活化型Caspase9、活化型Caspase3蛋白表達(dá)水平較MPP+組下降(均P<0.05)。見(jiàn)圖6、表2。

圖6 蛋白印跡試驗(yàn)結(jié)果

表2 4組細(xì)胞PINK、Parkin、a-Syn、活化型Caspase9、活化型Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示當(dāng)歸芍藥散的主要成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、芍藥苷、兒茶素等。有研究顯示，豆甾醇通過(guò)下調(diào)核因子κB p65和p38MAPK的表達(dá)，顯著抑制促炎介質(zhì)(TNF、IL-6、IL-1、iNOS和環(huán)氧化酶2)的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的表達(dá)[15]。研究表明，兒茶素對(duì)血管生成和血管炎癥具有調(diào)節(jié)作用，且這類作用主要取決于VEGFA的水平，通過(guò)核因子κB依賴的途徑抑制IL-1β依賴的上皮細(xì)胞促炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[16]。芍藥苷是方中芍藥的主要活性成分，可通過(guò)激活腺苷A1受體來(lái)發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[17]；另外，芍藥苷可抑制炎癥和凝血激活，減輕脂多糖誘導(dǎo)的彌散性血管內(nèi)凝血[18]，還可通過(guò)抑制Src蛋白活化減少血管內(nèi)皮細(xì)胞-鈣黏附素的降解，從而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞-鈣黏附素的表達(dá)，以使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低，內(nèi)皮細(xì)胞間連接更加緊密[19]。由此推測(cè)，當(dāng)歸芍藥散中豆甾醇、芍藥苷、兒茶素等有效成分通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)血管生成、抑制血管炎癥和凝血激活作用，最終達(dá)到保護(hù)大腦神經(jīng)元的目的，有效延緩黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退化和進(jìn)行性缺失[20]。因此，當(dāng)歸芍藥散對(duì)帕金森病患者的黑質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用，可以延緩帕金森病患者的病程進(jìn)展，改善帕金森患者的運(yùn)動(dòng)遲緩癥狀[21]。

本研究通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，共篩選出19個(gè)當(dāng)歸芍藥散治療帕金森病的關(guān)鍵蛋白，包括IL-6、VEGFA、TNF、ESR1、PTGS2等。研究表明，多種神經(jīng)變性疾病的發(fā)生和發(fā)展與神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮了一定的作用[22]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，帕金森病患者的腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)、腦脊液及腓腸神經(jīng)中廣泛存在IL-6的結(jié)合位點(diǎn)[23]，其可促進(jìn)黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元壞死，引起帕金森病相關(guān)的病理性改變。另有研究顯示，帕金森病患者存在周圍感覺(jué)神經(jīng)損傷并伴有施萬(wàn)細(xì)胞的活化和炎癥，可能機(jī)制是炎癥反應(yīng)參與了軸突變性，使軸突與施萬(wàn)細(xì)胞的接觸功能障礙[24]，表明周圍神經(jīng)炎癥參與了帕金森病的病理生理過(guò)程。VEGFA是已知的研究最深入和最有效的促血管生成因子，其表達(dá)紊亂是血管生成異常的分子基礎(chǔ)，在炎癥的基礎(chǔ)上，VEGFA促使血管生成，這在很大程度上導(dǎo)致了血管系統(tǒng)的功能失調(diào)、血管通透性升高、血腦屏障遭受破壞，使得外周血細(xì)胞因子進(jìn)入中樞系統(tǒng)，從而引起相應(yīng)帕金森病癥狀[25]。此外，慢性炎癥狀態(tài)也是主要的血管生成刺激因素之一，TNF-α是單核巨噬細(xì)胞分泌的一種多效性調(diào)節(jié)因子，廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤的發(fā)生，是機(jī)體炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，而帕金森病患者外周血中的TNF-α 水平異常[26]，提示帕金森病發(fā)病過(guò)程中可能存在炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)的失調(diào)。另外，ESR1對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)保護(hù)作用[26]，其可能是通過(guò)抑制IL-6產(chǎn)生而發(fā)揮作用[27]。PTGS2的高表達(dá)與神經(jīng)元凋亡有關(guān)[28]。研究顯示，PTGS2抑制劑對(duì)帕金森病動(dòng)物模型中的多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，并能減輕多巴胺能神經(jīng)元的損傷[29]，這表明PTGS2可能通過(guò)作用于神經(jīng)遞質(zhì)參與帕金森病的發(fā)病過(guò)程。由此推測(cè)，當(dāng)歸芍藥散可能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮治療帕金森病的作用。

此外，CYCS、CAT、Caspase3也是當(dāng)歸芍藥散治療帕金森病的關(guān)鍵蛋白。抗氧化狀態(tài)異常不僅局限于黑質(zhì)紋狀體，還存在于外周紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞中[29]。研究表明，初發(fā)帕金森病患者的機(jī)體中存在氧化應(yīng)激反應(yīng)或者異常的抗氧化狀態(tài)[30]，氧化應(yīng)激可能參與了帕金森病的發(fā)病機(jī)制。而帕金森病患者CYCS與炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)之間具有相關(guān)性[31]。CAT是一種含血紅素的抗氧化酶，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)帕金森病患者外周紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞中的CAT活性顯著降低[32]；同時(shí)，血漿CAT活性下降與帕金森病患者姿勢(shì)不穩(wěn)定步態(tài)障礙評(píng)分增加有關(guān)[33]。由此可見(jiàn)，當(dāng)歸芍藥散可能通過(guò)調(diào)控這些關(guān)鍵靶標(biāo)來(lái)發(fā)揮抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用，從而達(dá)到治療帕金森病的目的。Caspase是一組存在于胞質(zhì)溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，其主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[34]，在帕金森病的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)Caspase是本研究篩選出的關(guān)鍵蛋白之一，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也涉及了該指標(biāo)。研究證實(shí)，帕金森患者黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的大量退化和進(jìn)行性缺失可進(jìn)一步激活Caspase蛋白，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[35]。本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散+MPP+組活化型Caspase3蛋白的表達(dá)水平較MPP+組下降(P<0.05)。這提示，當(dāng)歸芍藥散可能通過(guò)下調(diào)Caspase的表達(dá)，抑制由其介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)帕金森患者神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本研究的KEGG富集分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散對(duì)帕金森病的治療作用與TNF信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等多條信號(hào)通路有關(guān)。N-甲基-D-天冬氨酸型受體被谷氨酸激活后，參與鈣信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞外大量的外鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的大量增加激活了鈣離子依賴性蛋白酶，導(dǎo)致神經(jīng)元壞死、凋亡[22]。HIF-1信號(hào)通路主要由HIF-1及其調(diào)節(jié)子von Hippel-Lindau腫瘤抑制因子調(diào)控，能激活和調(diào)控VEGFA、NOS等帕金森病發(fā)病過(guò)程中的重要促炎細(xì)胞因子；此外，HIF-1誘導(dǎo)TP53積累后介導(dǎo)的黑質(zhì)或全身性炎性反應(yīng)是帕金森病發(fā)病的重要過(guò)程[36]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Toll樣受體主要表達(dá)于具有免疫功能的膠質(zhì)細(xì)胞中，在炎癥反應(yīng)以及免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)、存活和增殖中發(fā)揮顯著作用，其與IL-1受體相關(guān)激酶-4結(jié)合后，膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生磷酸化而被激活，然后Toll樣受體與細(xì)胞表面TNF受體相關(guān)因子6結(jié)合，最后導(dǎo)致抗炎因子c-Jun氨基末端激酶和核因子κB的表達(dá)，從而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用[37]。綜上，當(dāng)歸芍藥散可能通過(guò)參與鈣離子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等多條信號(hào)通路，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元、抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用，特異性抑制Toll樣受體的表達(dá)以阻斷神經(jīng)炎癥過(guò)程，可降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少促炎癥因子TNF-α、IL-1β等的表達(dá)，從而治療帕金森病。

α-Syn是存在于神經(jīng)元突觸前末端的神經(jīng)元蛋白，α-Syn過(guò)度聚集可能是帕金森病發(fā)病的重要機(jī)制。本研究中，MPP+組的α-Syn蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但當(dāng)歸芍藥散+MPP+組的α-Syn蛋白表達(dá)水平較MPP+組下降(P<0.05)，提示當(dāng)歸芍藥散可能是一種有效的α-Syn聚集抑制劑，其通過(guò)抑制α-Syn在神經(jīng)元的過(guò)度聚集而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。PINK1是一種存在于線粒體內(nèi)膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PINK1的N端則主要定位于線粒體外膜，Parkin是一種泛素E3連接酶。研究表明，PINK1/Parkin通路通過(guò)調(diào)控泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、線粒體質(zhì)量和自噬來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受各類應(yīng)激引起的損害[38]。PINK1能選擇性地聚集在去極化的線粒體外膜上，通過(guò)泛素鏈的磷酸化募集并激活Parkin，最終誘導(dǎo)受損的線粒體自噬降解[39]。同時(shí)，Parkin 可以增強(qiáng)受損線粒體的自噬[40]。二者能有效維持線粒體的形態(tài)、功能和DNA的穩(wěn)定，進(jìn)而保護(hù)線粒體DNA免受活性氧的損傷，并激發(fā)線粒體的自我修復(fù)過(guò)程[41]。有研究顯示，在帕金森病小鼠模型中，Parkin過(guò)表達(dá)能預(yù)防神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，防止MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元變性和運(yùn)動(dòng)功能障礙[42]。在PINK1缺失的小鼠中，黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元對(duì)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)元變性更敏感，過(guò)表達(dá)PINK1可以減少M(fèi)MP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)阻斷線粒體中細(xì)胞色素C的釋放和活化型Caspase3的激活而發(fā)揮作用[43]。蛋白酶激活被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡中的重要一步，內(nèi)源性途徑主要以線粒體作為細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，損傷后釋放出的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子Bax及Caspase9結(jié)合形成凋亡小體，而被活化的活化型Caspase9則繼而激活活化型Caspase3，引起細(xì)胞凋亡[44-45]。本研究結(jié)果顯示，MPP+組，PINK1和Parkin蛋白的表達(dá)較對(duì)照組下降，而活化型Caspase9和活化型Caspase3蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組增加，而當(dāng)歸芍藥散+MPP+組PINK1和Parkin蛋白的表達(dá)較MPP+組上升，且活化型Caspase9和活化型Caspase3蛋白的表達(dá)均較MPP+組有所下降(均P<0.05)。這表明，在帕金森病的細(xì)胞模型中，當(dāng)歸芍藥散的含藥血清可以顯著增加泛素鏈的磷酸化，減少活化型Caspase9和活化型Caspase3的表達(dá)，從而達(dá)到抑制MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的作用，發(fā)揮保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。

綜上所述，當(dāng)歸芍藥散可通作用于IL-6、VEGFA、TNF、CAT、PTGS2等多靶點(diǎn)，以及調(diào)節(jié)TNF信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等，發(fā)揮治療帕金森病的作用。但具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究深入探討，后續(xù)也還需要深入探討長(zhǎng)期有效控制病情穩(wěn)定的治療方案，為中醫(yī)藥防治帕金森病提供新的思路。