梅 靜 喇宏玲 徐桂萍

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科,烏魯木齊市 830001，電子郵箱：my7future7@163.com)

人類神經(jīng)發(fā)育過程中接觸麻醉劑會導致神經(jīng)變性和長期神經(jīng)行為異常，例如學習障礙和記憶障礙等[1]。孕中期是神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元遷移的時期，在此期間胎兒對外部環(huán)境十分敏感。而隨著腹腔鏡手術和胎兒手術的迅速發(fā)展，越來越多的孕婦在懷孕期間，特別是在孕中期進行手術。因此，麻醉劑對胎兒出生前神經(jīng)發(fā)育的影響受到越來越多學者的關注。已有研究表明，丙泊酚可能對子代長期行為產(chǎn)生影響，但其結論仍然存在很大的爭議[2-3]。因此，需要進一步研究丙泊酚對孕中期胎兒神經(jīng)發(fā)育的影響及其機制。研究證實，鈣離子-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的磷酸化或激活，可激活環(huán)磷酸腺苷效應元件結合蛋白(cyclic AMP responsive element binding protein,CREB)從而影響個體的學習和空間記憶，對海馬區(qū)的記憶功能鞏固發(fā)揮著關鍵作用[4-5]。但目前關于丙泊酚麻醉孕中期大鼠對子代海馬組織中CaMKⅡ/CREB信號通路的影響的研究較少。因此，本研究探討丙泊酚麻醉孕中期大鼠對子代學習和記憶缺陷的影響，并觀察CaMKⅡ/CREB信號通路在其中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑與耗材 72只8周齡成年無特定病原體級SD雌性大鼠和24只雄性大鼠購于新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心[生產(chǎn)許可證號為SYXK(新)2016-0001，質(zhì)量合格證號為NO.65000200000364]。生長相關蛋白43(growth-associated protein 43,GAP43；批號：ab75810)、突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95；批號：ab238135)、B細胞淋巴瘤蛋白-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2；批號：ab182858)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax；批號：ab32503)、Caspase3(批號：ab32351)、Cleaved-caspase3(批號：ab32042)、CaMKⅡ(批號：ab181052)、CREB(批號：ab32515)、磷酸化CREB(phosphorylated-3-CREB,p-CREB；批號：ab32096)和內(nèi)參蛋白GAPDH(批號：ab9485)一抗和二抗(批號：ab6721)均購于美國Abcam公司；視頻跟蹤系統(tǒng)購于上海移動數(shù)據(jù)有限公司(型號：XR-XM101)；丙泊酚購于美國Sigma Aldrich公司(批號：2078-54-8)，KN-93磷酸鹽購于美國Selleck化學公司(批號：S7423)，尼氏染色試劑盒購于上海碧云天公司(批號：C0117)，戊巴比妥鈉(分析純)購于德國默克公司(批號：20160411)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)環(huán)境：成年SD大鼠飼養(yǎng)于在(24±1)℃的環(huán)境中，光照/黑暗周期為12 h/12 h，動物自由攝食和飲水。所有實驗程序和實驗方案均獲得我院實驗動物倫理委員會批準[文號PHXUAR-LL-2020-0453-R]，并按照美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物的護理和使用指南》[6]的原則，使所用動物的總數(shù)及動物的痛苦最小化。

1.2.2 孕鼠的麻醉劑暴露和剖腹探查術：將3只雌鼠與1只雄鼠關于一籠中(共24籠)，進行自由交配。第2天通過目測觀察每只雌鼠的陰道栓子聯(lián)合陰道涂片檢測來判斷是否存在精子，如存在則認為受孕成功，并定義為孕0 d，由此推算并選擇孕期為14 d的母鼠進行實驗(本研究中每只雌鼠均檢測到精子并存在陰道栓子)。于自制透明塑料瓶中固定孕期為14 d的72只雌性大鼠，采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，行頸內(nèi)靜脈穿刺放置靜脈導管。使用隨機數(shù)字表法將雌鼠分為4組，每組18只，其中對照組(C組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射2 mL/kg生理鹽水后不做任何處理；丙泊酚低劑量組(L組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射1.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉誘導，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注1.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術，麻醉時間4 h；丙泊酚中劑量組(M組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射1.5%的丙泊酚2 mL/kg進行麻醉誘導，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注1.5%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術，麻醉時間4 h；丙泊酚高劑量組(H組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射2.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉誘導，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注2.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術，麻醉時間4 h。

1.2.3 剖腹探查術：以翻正反射消失作為動物麻醉誘導成功的標準。成功麻醉誘導后剪去L組、M組、H組大鼠的腹毛，對露出的皮膚使用75%無菌酒精消毒3遍，使用0.125%丁哌卡因(0.2 mL/只)進行局部麻醉，于腹部正中做一長約3 cm的縱向切口。無菌探查腹腔范圍包括膈肌(肝臟)、盆腔、膀胱、兩側腹中線水平(脾臟或腎)；隨后用2 mL的37℃無菌生理鹽水沖洗腹腔，吸凈液體，用75%酒精消毒切口。采用4-0縫線間斷縫合腹膜和肌層，采用3-0縫線間斷縫合皮膚并消毒，擦干切口血漬。在25 min內(nèi)完成手術。大鼠蘇醒后放回原籠，繼續(xù)妊娠。

1.2.4 圍術期監(jiān)測：麻醉各組動物后，采用RM6240生理信號采集處理系統(tǒng)、血壓計、血氣分析儀分別監(jiān)測其心電圖、血壓、血氧飽和度，麻醉結束后立即從母鼠髂外靜脈取血進行血氣分析。麻醉期間監(jiān)測孕鼠血氧飽和度、血壓、心率，剔除血氧飽和度<95%或平均動脈壓超出/低于基礎值20%的孕鼠。從上述4組中每組隨機選12只血氧飽和度、血壓、心率正常的孕中期大鼠，進行后續(xù)實驗。

1.2.5 收集生殖發(fā)育參數(shù)：統(tǒng)計上述的48只孕鼠的妊娠時長，即從孕0 d開始到子代出生，以及子代大鼠的性別比例、數(shù)量和體重。

1.2.6 檢測子代的學習記憶功能：子鼠出生后30 d，從各組母鼠所產(chǎn)的所有雄性子代中按隨機數(shù)字表法選擇30只，進行學習和空間記憶檢測(為排除發(fā)情周期對嚙齒動物行為的影響，僅對雄性子代進行了行為測試)。采用Morris水迷宮系統(tǒng)(美國CoulBOURN公司)檢測大鼠的學習記憶功能。將Morris水迷宮系統(tǒng)(直徑1.6 m、深0.6 m，第Ⅱ象限中有可移動的圓柱形平臺直徑0.15 m)置于固定的測試間內(nèi)，每日8：00開始測試，水溫(23±1)℃，第Ⅱ象限的平臺在水下1 cm，每日訓練1次。第1～5天(出生后30～34 d)觀察大鼠的定位航行能力，即從離平臺最遠的第Ⅲ象限選擇一固定入水點將大鼠背對平臺放入水中；若90 s內(nèi)大鼠找到平臺，則將其留在平臺上20 s，若90 s內(nèi)未能找到，將其引上平臺同樣停留20 s。記錄大鼠尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期，若90 s內(nèi)未找到平臺，按90 s計算。第6天(出生后35 d)行空間探索實驗，撤去水中平臺，于固定的進入點將大鼠放入水中，記錄90 s內(nèi)在第Ⅱ象限停留時間及穿越原平臺次數(shù)。每次試驗后，干燥大鼠毛發(fā)并用熱燈溫暖5 min，然后再放回常規(guī)籠。取所測雄性子代的平均值作為最終測定結果。

1.2.7 抑制劑注射和學習、空間記憶測試：由于實驗結果顯示M組和H組劑量丙泊酚對子代學習記憶缺失的影響高于L組，且H組與M組子代學習記憶缺失的影響無明顯差異，因此選擇M組子代用于機制研究。于M組的雄性子代出生后36 d(測試完成后1 d)隨機選取6只，腹腔注射CaMKⅡ的特異性抑制劑KN-93磷酸鹽0.5 mg/kg，用生理鹽水溶解至2.5 mL，1次/d，持續(xù) 7 d (出生后36～42 d)，作為M+KN-93組。另取出生后36 d的M組雄性子代大鼠作為對照，腹腔注射2.5 mL生理鹽水(1次/d，持續(xù)7 d)，作為M+saline組。于出生后43～48 d使用Morris水迷宮法檢測大鼠子代的學習記憶能力。

1.2.8 Western blot分析：在C組、L組、M組、H組、M+KN-93組及M+saline組的子代大鼠完成最后一次Morris水迷宮測試后，采用隨機數(shù)字表法在每組選擇3只子代大鼠,斷頭法處死后分離腦海馬組織。海馬組織勻漿后用RIPA裂解緩沖液提取海馬組織總蛋白，用于測定GAP43、PSD95、凋亡標志物(Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3、CaMKⅡ，CREB、p-CREB、GAP43、PSD95的表達。經(jīng)過SDS-PAGE分離并隨后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、Caspase3(1 ∶500)、Cleaved-Caspase3( 1 ∶1 000)、CaMKⅡ(1 ∶1 000)、CREB(1 ∶600)、p-CREB(1 ∶800)、GAP43(1 ∶1 000)、PSD95(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)的一抗4℃孵育過夜，用1×Western Wash Buffer洗滌3次，每次5 min。洗滌后用辣根過氧化物酶結合的免疫球蛋白G抗體(二抗)孵育1 h，用1×Western Wash Buffer洗滌3次，每次5 min。通過增強化學發(fā)光法使蛋白條帶顯色，使用Amersham Biosciences ECL檢測系統(tǒng)掃描蛋白條帶，并通過ImageJ軟件進行定量，實驗重復3次。

1.2.9 尼氏染色觀察神經(jīng)元的密度：選擇M+KN-93組及M+saline組的出生后48 d的子代大鼠各3只，經(jīng)斷頭法處死，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流，然后取出腦組織，并在4℃下于4%多聚甲醛中固定過夜。石蠟包埋后，距前囟3.3 mm處行冠狀切片(厚4 μm)，并行尼氏染色。使用數(shù)字顯微鏡照相機(德國徠卡公司)捕獲CA1區(qū)域的錐體細胞層的代表性顯微照片。每只大鼠計算3張尼氏染色切片的細胞圖像。由兩名工作人員使用ImageJ軟件以盲法對尼氏染色陽性神經(jīng)元細胞進行計數(shù)。實驗重復3次。神經(jīng)元密度=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間采用t檢驗或單因素方差分析(采用LSD-t進行多重比較)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對雌鼠生殖結局和子代體格發(fā)育參數(shù)的影響 4組雌鼠的妊娠時長、每只雌鼠產(chǎn)仔數(shù)、子代雄雌比、雄性子代體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 4組雌鼠生殖結局和子代發(fā)育參數(shù)的比較(x±s)

2.2 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對子代學習記憶能力的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數(shù)均減少，第Ⅰ象限的停留時間均延長，而第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；與L組大鼠雄性子代相比，M組和H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數(shù)均減少，第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；而M組和H組大鼠雄性子代上述指標差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠雄性子代Morris水迷宮系統(tǒng)檢測指標的比較(x±s)

組別n平臺穿越次數(shù)(次)各象限停留時間(s)ⅠⅡⅢⅣC組305.724±0.9729.213±1.45343.561±6.98827.536±4.03511.545±2.164L組303.584±0.671a18.891±3.094a32.564±3.162a26.563±4.31412.191±2.971 M組302.474±0.433ab17.244±2.552a19.672±2.711ab26.644±1.66012.094±2.385 H組302.094±0.213ab17.012±1.231a15.694±1.302ab27.941±2.32113.172±2.562 F值176.11682.652225.14521.55217.632P值0.0110.0310.0090.0620.115

2.3 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對子代海馬區(qū)凋亡相關蛋白表達的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代海馬區(qū)的Bax、Cleaved-Caspase3表達量均上調(diào)， Bcl-2、GAP43、PSD95表達量均下調(diào)(均P<0.05)；與L組比， M組、H組大鼠雄性子代海馬區(qū)的Bax、Cleave-Caspase3表達量均上調(diào)，Bcl-2、GAP43、PSD95表達量均下調(diào)(均P<0.05)；而4組大鼠雄性子代海馬區(qū)的Caspase3表達量，以及M組與H組上述蛋白表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見圖1、表3。

圖1 4組凋亡相關蛋白電泳條帶圖

表3 4組大鼠雄性子代海馬區(qū)凋亡相關蛋白相對表達量的比較(x±s)

2.4 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對子代海馬組織CaMKⅡ/CREB信號通路激活的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代海馬組織的CaMKⅡ蛋白表達量均上調(diào)，p-CREB蛋白表達量均下調(diào)；與L組相比，M組、H組大鼠雄性子代海馬區(qū)的CaMKⅡ蛋白表達量均上調(diào)，p-CREB蛋白表達量均下調(diào)(均P<0.05)；而4組大鼠雄性子代海馬區(qū)的CREB蛋白表達量，以及M組與H組上述蛋白表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見圖2、表4。

圖2 4組CaMKⅡ/CREB信號通路蛋白電泳圖

表4 4組大鼠雄性子代海馬區(qū)CaMKⅡ、CREB、p-CREB蛋白相對表達量的比較(x±s)

2.5 KN-93磷酸鹽對大鼠雄性子代學習記憶能力的改善作用 在出生后48 d，與M+saline組相比，M+KN-93組大鼠雄性子代的逃避潛伏期變短，平臺穿越次數(shù)增加，第Ⅱ象限停留時間延長，海馬組織中CaMKⅡ蛋白表達量下調(diào)，p-CREB、GAP43、PSD95蛋白表達量上調(diào)，神經(jīng)元細胞密度增加(均P<0.05)。見表5～6和圖3～4。

表5 兩組大鼠雄性子代Morris水迷宮測試結果的比較(x±s)

表6 兩組大鼠海馬區(qū)相關蛋白相對表達量和神經(jīng)元細胞相對密度的比較(x±s)

圖3 兩組雄性子代海馬區(qū)尼氏染色結果(×200)

圖4 兩組大鼠海馬區(qū)相關蛋白電泳圖

3 討 論

盡管既往已有研究證實在胎兒期接觸丙泊酚對其長期神經(jīng)發(fā)育結局的影響，但研究結果仍存在爭議[7-8]。有研究表明， 2.5%丙泊酚單次暴露2 h可損害子代小鼠的學習和記憶功能[9]。然而，另一項類似的研究表明，懷孕小鼠接觸丙泊酚不會導致子代小鼠出現(xiàn)學習行為異常[10]。上述研究之間的差異可能與物種、麻醉方案的差異(確切孕齡、麻醉劑類型、劑量、暴露時間等)或行為測試的敏感性有關。本研究采用孕14 d的大鼠進行實驗，此階段被認為與人類妊娠的孕中期相似[11]。本研究中孕中期大鼠丙泊酚的暴露方式為：經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射(1.0%、1.5%、2.0%)2 mL/kg丙泊酚進行麻醉誘導，然后以 20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注丙泊酚，并行剖腹探查手術，麻醉時間為 4 h，該時間長度與臨床真實情況更類似。然而在一些臨床手術中，為了放松子宮平滑肌并為胎兒干預提供足夠的麻醉，胎兒腦部可能會遭受到濃度更高的麻醉劑造成的損害[12]。因此，本研究觀察不同濃度(1.0%、1.5%、2.0%)的丙泊酚麻醉對大鼠子代學習記憶的影響。本研究結果顯示，C組、L組、M組、H組雌性大鼠的妊娠期、每只雌鼠產(chǎn)仔數(shù)、子代雄雌比、雄性子代體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，說明孕中期接觸丙泊酚未對雌性大鼠生殖結局和雄性子代體格發(fā)育造成影響。本研究的Morris水迷宮測試結果表明，與C組大鼠雄性子代相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數(shù)均減少，第Ⅰ象限的停留時間均延長、第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；與L組大鼠雄性子代相比，M組和H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數(shù)均減少，第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；而M組和H組大鼠雄性子代上述指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。這說明孕中期大鼠接觸低、中、高濃度的丙泊酚均能引起雄性子代的學習和記憶能力部分缺失，且中、高濃度丙泊酚的作用更明顯。

研究表明，CaMKⅡ的磷酸化或激活對海馬區(qū)的記憶的鞏固發(fā)揮著關鍵作用[13]，而且海馬CaMKⅡ/CREB信號通路在藥物誘導學習記憶功能衰退中具有重要意義。已有研究證實CaMKⅡ/CREB信號通路介導了重金屬誘導動物的學習記憶能力衰退，其中海馬區(qū)CaMKⅡ激活受到抑制和CREB激活(CREB磷酸化)增加是改善認知功能障礙的關鍵[14]。本研究結果顯示，不同濃度丙泊酚麻醉孕中期大鼠后，其雄性子代的學習記憶能力明顯降低。Caspase3經(jīng)過切割、活化之后會變成Cleaved-Caspase3，而后者是高活性的細胞凋亡激活酶，本研究結果顯示，各丙泊酚干預組中海馬區(qū)Cleaved-Caspase3表達量增加，同時凋亡標志物Bax蛋白表達量也增加，而且凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達量降低(均P<0.05)，這表明丙泊酚對海馬神經(jīng)元可能有促凋亡的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，各丙泊酚干預組中大鼠雄性子代大腦海馬區(qū)CaMKⅡ的激活增加以及CREB的激活減少，表現(xiàn)為CaMKⅡ的磷酸化水平上調(diào)，而CREB的磷酸化受到抑制，而且中、高濃度丙泊酚的作用更明顯；使用CaMKⅡ抑制劑抑制其激活時，伴隨著海馬區(qū)CREB激活的增加，子代大鼠的學習記憶能力明顯恢復。這些結果表明丙泊酚麻醉孕中期大鼠可通過激活CaMKⅡ/CREB信號通路影響雄性子代的學習、記憶能力。另外，本研究結果顯示，不同濃度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠可降低其雄性子代海馬區(qū)突觸可塑性相關蛋白PSD95和GAP43的表達量，而有趣的是，當使用CaMKⅡ抑制劑抑制其激活后，大鼠雄性子代海馬組織的神經(jīng)元細胞密度增加，而且海馬區(qū)PSD95和GAP43蛋白的表達量均上調(diào)。這表明海馬區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目及PSD95、GAP43表達可能受到CaMKⅡ/CREB信號通路調(diào)節(jié)。有學者發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ/CREB信號通路在海馬神經(jīng)元保護和突觸可塑性中的主導作用[15]。

本研究存在幾個局限性：首先，由于為了減少實驗中處死動物的數(shù)量，本研究僅選擇中劑量丙泊酚組(M組)大鼠的子代作為機制研究，所得結果可能會有偏倚；其次，為避免子代大鼠受發(fā)情期的影響，本研究中僅選用大鼠雄性子代作為研究對象，丙泊酚對于大鼠雌性子代的影響仍需進一步研究。

綜上所述，使用不同濃度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠均會導致雄性子代的學習、記憶功能下降，并伴有海馬組織CaMKⅡ蛋白表達上調(diào)及CREB激活程度降低，抑制CaMKⅡ表達可提高大鼠雄性子代的學習、記憶功能，其作用機制可能與CREB激活有關，CaMKⅡ/CREB信號通路可能是治療孕中期丙泊酚暴露致子代學習、記憶能力缺失的關鍵靶點。