葛玉東

(許昌市婦幼保健院 醫(yī)學(xué)檢驗科，河南 許昌 461000)

遺傳性耳聾(hereditary hearing loss，HHL)是一種臨床常見的出生缺陷，部分患兒在出生后即對聲音無反應(yīng)，若不佩戴助聽器、接受語言訓(xùn)練，則無法與外界正常交流且阻礙其智力發(fā)育，給其家庭及社會造成嚴重負擔[1-2]。耳聲發(fā)射(transi entevoked otoacoustic emission，TEOAE)與自動聽性腦干反應(yīng)(auto-mated auditory brainstem response，AABR)是新生兒聽力篩查的主要方法，其中TEOAE主要是通過檢測外耳道至耳蝸外毛細胞功能以判斷受檢者聽力狀況，靈敏度與特異度均較高，但受呼吸、環(huán)境噪聲、中耳羊水、外耳道內(nèi)胎脂等因素的影響，可能出現(xiàn)假陽性，且無法檢出蝸后病變[3-4]。AABR不受新生兒意識的影響，可檢出聽神經(jīng)功能障礙，判斷耳聾性質(zhì)，定位病變部位，但該檢查方式對操作人員專業(yè)技術(shù)要求較高，所需費用高昂，耗時長，故而臨床應(yīng)用受到一定限制[5-6]。微陣列基因芯片是一種分子診斷技術(shù)，主要是采用微量點樣、光導(dǎo)原位等方法將多肽分子、核酸片段、組織切片等生物大分子樣品有序地固化于尼龍膜、玻片等支持物表面，而后與一組已標記的待測生物樣品中靶分子反應(yīng)，采用特定的掃描儀進行靶分子數(shù)量測定的檢查方法，可識別特異性耳聾基因，且具有檢查費用低、耗時短的優(yōu)勢[7]。鑒于此，本研究探討微陣列基因芯片技術(shù)在新生兒HHL篩查中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準。收集2020年1月至2021年10月于許昌市婦幼保健院接受HHL篩查的51 409例新生兒的臨床資料。(1)納入標準：①新生兒父母存在聽力障礙；②新生兒父母聽力良好，但其直系親屬存在聽力障礙；③新生兒父母已經(jīng)生育有聽力障礙的小兒。(2)排除標準：①合并先天性小耳畸形；②合并先天性腦部發(fā)育不全。51 409例新生兒中男27 741例，女23 668例；胎齡37～41(38.82±0.64)周；出生體質(zhì)量2 480～4 920 g(3 364.52±193.54)g；日齡3～19(7.82±2.03)d；自然分娩33 652例，剖宮產(chǎn)17 757例。

1.2 微陣列基因芯片技術(shù)檢查采集新生兒足跟靜脈血均勻滴在采血卡上，單獨密封包裝送至實驗室，使用微陣列基因芯片(北京博奧生物)檢測常見的4個耳聾基因中的15個位點[GJB2(235delC、299-300delAT、176-191de1、35de1G)、GBJ3(538C>T)，SLC26A4(IVS7-2A>G、1229C>T、2168A>G、1975G>C、1226G>A、1174A>T、IVS15+5G>A、2027T>A)、12SrRNA(1555A>G、1494C>T)]。微陣列基因芯片技術(shù)流程：(1)芯片制備，即采用組合化學(xué)或表面化學(xué)處理固相基質(zhì)，而后將探針依據(jù)特定順序排列在基片上；(2)樣品制備，即提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，在待測的核酸片段上標記不同的熒光或同位素等作為靶片段；(3)雜交反應(yīng)，即將cDNA與芯片探針結(jié)合，漂洗除去cDNA；(4)檢測并分析芯片信號，即通過特定的掃描儀獲取雜交后的信號，而后進行計算機分析。HHL微陣列基因芯片檢測結(jié)果陽性的新生兒，進行基因測序檢驗，結(jié)果符合后通知家長領(lǐng)取檢測報告，并提供遺傳咨詢。

1.3 觀察指標針對HHL微陣列基因芯片檢測結(jié)果陽性的新生兒進行基因測序檢驗，觀察基因測序結(jié)果及雜合突變類型。以基因測序檢驗為金標準，分析微陣列基因芯片技術(shù)在HHL新生兒基因篩查中的診斷效能并觀察其診斷新生兒HHL雜合突變類型與基因測序檢驗結(jié)果一致性。

2 結(jié)果

2.1 51 409例新生兒HHL微陣列基因芯片檢測結(jié)果51 409例新生兒經(jīng)HHL微陣列基因芯片檢測，結(jié)果顯示陽性2 694例(5.24%)，陰性48 715例(94.76%)。

2.2 HHL微陣列基因芯片檢測結(jié)果陽性的新生兒基因測序檢驗結(jié)果經(jīng)基因測序驗證，2 694例HHL微陣列基因芯片檢測陽性的新生兒均為陽性，其中GJB2基因雜合突變型1 379例(51.19%)，GJB3基因雜合突變型199例(7.39%)，SLC26A4基因947例(35.15%)，線粒體12SrRNA基因164例(6.09%)，雙雜合突變型5例(0.19%)。

2.3 微陣列基因芯片技術(shù)診斷新生兒HHL雜合突變類型與基因測序檢驗結(jié)果的一致性分析微陣列基因芯片技術(shù)診斷新生兒HHL雜合突變類型與基因測序檢驗結(jié)果一致性較好(Kappa=0.884，P<0.05)。見表1。

表1 微陣列基因芯片技術(shù)診斷雜合突變類型與基因測序檢驗結(jié)果分析(n)

3 討論

我國HHL患兒基因攜帶率約為4.5%，耳聾基因所致的HHL發(fā)病率較高[8]。聽力異?？蓪π律鷥赫Z言發(fā)育及認知功能產(chǎn)生嚴重不良影響，增加其后期學(xué)習(xí)難度，甚至造成永久性殘疾。現(xiàn)階段，我國已經(jīng)展開新生兒聽力篩查，包括TEOAE與AABR等檢查方式，可檢出大部分HHL患兒。但仍有部分HHL基因攜帶者出生后無耳聾表現(xiàn)，而是在數(shù)月或數(shù)年后發(fā)病，進而造成常規(guī)新生兒聽力篩查方法難以早期發(fā)現(xiàn)潛在耳聾，不利于早期采取預(yù)防措施，影響患兒預(yù)后。由此可見，推廣HHL的基因篩查十分必要。

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，GJB2基因突變、線粒體12SrRNA基因突變、SLC26A4基因突變是我國正常人群中攜帶率較高的致聾基因，運用適當?shù)幕蚝Y查方法進行基因診斷對提高HHL檢出率具有積極意義[9]。本研究采用微陣列基因芯片技術(shù)篩查新生兒HHL，結(jié)果顯示，51 409例新生兒中陽性2 694例(5.24%)。進一步經(jīng)基因測序檢驗，結(jié)果顯示，2 694例HHL微陣列基因芯片檢測陽性的新生兒均為陽性，其中GJB2基因雜合突變型1 379例，GJB3基因雜合突變型199例，SLC26A4基因947例，線粒體12SrRNA基因164例，雙雜合突變型5例。GJB2是HHL最常見的突變基因，GJB2基因編碼產(chǎn)物跨膜蛋白Cx26在信息傳遞、物質(zhì)交換中起到重要作用。而Cx26廣泛分布于耳蝸的血管紋、耳蝸傳導(dǎo)纖維、神經(jīng)感覺上皮、基底細胞、螺旋凸緣等部位，是細胞間電解質(zhì)、代謝物質(zhì)、第二信使的重要通道，因此攜帶GJB2突變基因可大大增加耳聾概率[10-11]。攜帶GJB2突變基因的新生兒日常生活中需遠離噪音，預(yù)防頭部受傷，避免憋氣、用力咳嗽等，一旦發(fā)現(xiàn)異常需及時就醫(yī)。SLC26A4也是HHL常見的突變基因，其檢出率僅次于GJB2，與大前庭水管綜合征密切相關(guān)。同時，攜帶SLC26A4突變基因的新生兒可誘發(fā)主要氨基酸置換，還可引發(fā)剪接突變或移碼突變，改變Pendrin蛋白的合成及功能，致使蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)障礙，打破細胞內(nèi)外環(huán)境平衡，引起耳聾。攜帶SLC26A4突變基因的新生兒出生時大都無耳聾表現(xiàn)，受誘因刺激或隨外界環(huán)境變化聽力呈波動性下降，最終發(fā)展為耳聾[12-13]。因此，該基因突變攜帶者應(yīng)禁止倒立或劇烈體育運動，預(yù)防感冒等外界刺激，以預(yù)防耳聾發(fā)生。線粒體12SrRNA突變基因與藥物性耳聾密切相關(guān)，可導(dǎo)致氨基糖苷類藥物性耳聾，其中1555A>G、1494C>T是常見的藥物性耳聾的突變點位，線粒體12SrRNA基因突變可在12S rRNA的A區(qū)形成新的結(jié)合堿基對，由此生成的12S rRNA二級結(jié)構(gòu)類似于細菌16S rRNA結(jié)構(gòu)[14]。因此，攜帶線粒體12SrRNA突變基因的患兒對氨基糖苷類抗生素具有高度敏感性，需絕對禁止使用此類抗生素，以降低耳聾發(fā)生率。GJB3的538C>T突變點位可改變其編碼Cx31蛋白的功能與結(jié)構(gòu)，影響細胞間隙連接，引起HHL，但該突變基因檢出率較低，其與HHL的關(guān)系仍需進一步觀察探討。

遺傳學(xué)研究表明，人體基因中與耳聾相關(guān)的基因超過200個，通過診斷耳聾基因可篩選基因突變攜帶者，在耳聾家族史缺少的情況下可利用智能基因診斷出耳聾個體及親屬，從而及時采取干預(yù)措施[15]。微陣列基因芯片技術(shù)是一種耳聾基因篩查工具，固有的高效平行為其主要檢測特點，其高度與耳聾基因高遺傳異質(zhì)性相契合，檢測耳聾基因的潛力極高[16]。本研究結(jié)果顯示，微陣列基因芯片技術(shù)診斷新生兒HHL雜合突變類型與基因測序檢驗結(jié)果一致性較好(Kappa=0.884)，表明微陣列基因芯片技術(shù)在新生兒HHL篩查中具有良好的應(yīng)用價值。微陣列基因芯片技術(shù)將探針分子固化于支持物上，而后與標記的待測生物樣品靶分子進行雜交，通過電荷偶聯(lián)攝影像機或激光共聚掃描儀檢測每個探針分子的雜交信號強度而獲取待測生物樣品靶分子的序列信息和數(shù)量。同時，通過統(tǒng)計芯片檢測結(jié)果中的野生型與突變型的平均熒光信號值，設(shè)定二者之間的分界值，并采用軟件自動判讀，避免采用肉眼觀察而出現(xiàn)錯誤，提高診斷準確度[17-18]。此外，微陣列基因芯片技術(shù)一次可檢測多張芯片，一張芯片可同時檢測多個個體，且試劑價格低廉，對儀器要求相對較低，具有低成本、高通量、耗時短等優(yōu)勢，能夠有效滿足臨床需求。

綜上所述，微陣列基因芯片技術(shù)在新生兒HHL篩查中具有良好的應(yīng)用價值，可明確大部分患兒的基因攜帶情況，進而為早期聽力損傷防護和干預(yù)提供指導(dǎo)。此外，不同家庭進行HHL基因診斷的目的不同，包括尋找治療方案、確定耳聾原因、評估后代患病風險等，臨床應(yīng)依據(jù)家庭個體情況進行遺傳咨詢。