李靜文，吳欣愛，董文杰，陳璐璐，張利蘋

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是第三大常見死亡率高的腫瘤類型[1]。近年來，CRC治療方面已取得了巨大的成就，手術(shù)切除是最有效的方法，但在延長生存期及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的效果仍需提高。因此，迫切需要更深入地研究分子機(jī)制，以尋找出CRC的早期診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)[2-3]。雙特異性磷酸酶2(dual specificity phosphatase 2，DUSP2)是DUSP中的一員，通過磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸殘基(1，2)的直接去磷酸化來特異性地抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號[4]，而MAPK級聯(lián)的異常調(diào)節(jié)會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。DUSP2可以負(fù)調(diào)節(jié)ERK1/2蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而決定ERK1/2的活性。ERK1/2蛋白通過磷酸化狀態(tài)的改變促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移并增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄，在癌癥的發(fā)展和進(jìn)程中具有多種作用[5]。本文通過構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)DUSP2的SW480細(xì)胞株，探討下調(diào)的DUSP2對SW480細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人大腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞系，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、0.25%胰酶(美國Hyclone公司)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(美國 Vazyme公司)， 嘌呤霉素、RIPA裂解液、羊抗兔二抗(北京索萊寶科技有限公司)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)；DUSP2、ERK、p-ERK、p38、p-p38、多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶-1(poly adenosine diphosphate-ribose polymerase-1，PARP1)蛋白抗體(英國abcam公司)；兔抗鼠二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(武漢博士德工程有限公司)。CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher Scientific公司；電泳槽、電泳儀購自Bio-Rad公司。引物合成及測序由尚亞生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 檢測方法

1.2.1CRC患者預(yù)后價值評估 通過分析癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)中CRC患者DUSP2基因的表達(dá)情況來評估DUSP2對CRC患者的預(yù)后價值。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞系SW480由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、95%濕度條件下，在DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT)中培養(yǎng)，加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(HyClone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT)、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素(Invitgen；Thermo Fisher Science)。

1.2.3shRNA轉(zhuǎn)染 用慢病毒轉(zhuǎn)染靶向敲低DUSP2的shRNA(實驗組)和空載shRNA(對照組)。轉(zhuǎn)染溫度為37 ℃，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。shRNA由上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司設(shè)計合成。當(dāng)SW480細(xì)胞在6孔板中達(dá)到50%匯合時，加入5 μL shRNA混合在最終體積為1 000 μL的培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后評價細(xì)胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測DUSP2mRNA表達(dá)量 采用Trizol法對數(shù)生長期的實驗組及對照組的SW480細(xì)胞抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃ 5 min。以上述細(xì)胞的cDNA為模板，通過qRT-PCR分別檢測管家基因β-actin(內(nèi)參)和DUSP2mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。引物序列：DUSP2引物上游5’-CCACCCATGGCAAAT TCCATGGCA-3’，下游5’-GCCTCGCTCTCCACAGCC-3’；β-actin引物上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCCGAATGTCACGGCACGT-3’。最后采用2-△△CT相對定量法進(jìn)行分析。

1.2.5細(xì)胞劃痕試驗及細(xì)胞遷移試驗評估細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞劃痕試驗：在6孔板中種植6×105個細(xì)胞，在體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至匯合度為90%，用200 μL槍頭劃取5條水平線，并用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗3遍，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察實驗組與對照組劃痕區(qū)域愈合情況，并拍照記錄。細(xì)胞遷移試驗：在下室加入700 μL體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的培養(yǎng)基，上室加入105個細(xì)胞并用200 μL含體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，擦去上層表面細(xì)胞，PBS洗3遍后用40 g·L-1多聚甲醛固定15 min，再用20 g·L-1結(jié)晶紫染色15 min，晾干后至顯微鏡下拍照，評估實驗組與對照組穿過膜的情況。

1.2.6CCK-8測定細(xì)胞存活率 細(xì)胞以每孔5 000個細(xì)胞的密度種植在96孔板中。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8 (武漢博士德工程有限公司)及含體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基190 μL的混合物。1 h后用酶標(biāo)儀測量450 nm處的光密度(optical delnsity，OD)。從每孔中減去介質(zhì)的背景讀數(shù)以使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。將OD作為細(xì)胞存活的指標(biāo)。

1.2.7蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測目的蛋白表達(dá)量 收集細(xì)胞，去除上清液，用PBS(0.01 M，pH 7.2～7.3)洗滌2次。每皿細(xì)胞中加入裂解緩沖液RIPA(武漢博士德工程有限公司)，采用BCA測定蛋白濃度。細(xì)胞裂解物樣品經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE凝膠電泳，然后將溶解的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(GE Healthcare Life Sciences，Chalfont，UK)。然后用50 g·L-1牛血清白蛋白封閉膜1 h，并用抗DUSP2、ERK、p-ERK、p38、p-p38、PARP1蛋白抗體(稀釋度1∶1 000) 4 °C孵育過夜。然后與山羊抗兔單克隆抗體(稀釋度1∶10 000)在室溫下孵育1 h，之后使用ECL發(fā)光液對條帶進(jìn)行可視化，并通過AI600images捕獲圖像。

2 結(jié)果

2.1DUSP2表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系通過對TCGA中CRC患者DUSP2基因表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，DUSP2表達(dá)水平的高低與CRC患者的生存預(yù)后無關(guān)(P=0.728)。見圖1。

圖1 CRC患者DUSP2不同表達(dá)水平的生存曲線

2.2DUSP2敲低穩(wěn)定株的鑒定實驗組及對照組SW480細(xì)胞感染慢病毒并經(jīng)過嘌呤霉素篩選后，在熒光顯微鏡下觀察，其綠色熒光蛋白表達(dá)率在95%以上，見圖2；qRT-PCR檢測DUSP2mRNA表達(dá)量結(jié)果表明，實驗組SW480細(xì)胞中DUSP2mRNA表達(dá)水平低于對照組(t=5.140，P=0.014)，見圖3；western blot顯示實驗組SW480細(xì)胞中DUSP2蛋白表達(dá)水平較對照組下調(diào)(t=3.111，P=0.036)，見圖4。

A為實驗組熒光顯微鏡下表現(xiàn)；B為對照組熒光顯微鏡下表現(xiàn)。

2.3 細(xì)胞劃痕試驗及細(xì)胞遷移試驗DUSP2低表達(dá)組細(xì)胞劃痕區(qū)域閉合速度更快(t=15.280，P<0.001)，見圖5；24 h后穿過膜遷移至下層小室的數(shù)量更多(t=50.560，P<0.001)，見圖6。

A.用細(xì)胞劃痕試驗評估敲低DUSP2對SW480細(xì)胞遷移能力；B.實驗組與對照組劃痕寬度比值比較。

A.用細(xì)胞遷移試驗評估DUSP2下調(diào)對SW480細(xì)胞遷移能力的影響；B.實驗組與對照組透過膜細(xì)胞數(shù)量的比較。

2.4 CCK-8細(xì)胞增殖試驗48、72、96 h后DUSP2沉默組細(xì)胞的增殖速度高于對照組(t=5.607，P=0.005；t=7.078，P=0.002；t=11.270，P<0.001)。見圖7。

2.5 敲低DUSP2對ERK、p38磷酸化的影響western blot結(jié)果顯示，實驗組敲低DUSP2后ERK、p38的磷酸化水平較對照組均增加(t=2.937，P=0.043；t=5.275，P=0.006)，見圖8；低表達(dá)DUSP2使PARP1蛋白水平表達(dá)升高(t=4.457，P=0.002)，見圖9。

圖7 利用OD檢測敲低DUSP2對SW480細(xì)胞增殖的影響

A.采用蛋白質(zhì)免疫印記法檢測敲低DUSP2后ERK及p38磷酸化水平的變化；B.實驗組與對照組相對磷酸化水平的統(tǒng)計學(xué)分析。

A.利用蛋白質(zhì)免疫印記法檢測敲低DUSP2對PARP1蛋白表達(dá)的影響；B.實驗組與對照組PARP1表達(dá)量的統(tǒng)計學(xué)分析。

3 討論

大腸癌的發(fā)病過程是基因突變累積的過程，早期并無明顯癥狀，若患者通過外科手術(shù)治療，效果相對理想，但轉(zhuǎn)移及耐藥依舊是個難題，早期CRC患者的生存率已較前提高不少，但處于晚期的患者5 a生存率依舊不高[6]。21世紀(jì)提出精準(zhǔn)治療后靶向治療與免疫治療已經(jīng)有了巨大成效，但許多研究卻止于臨床療效，所以尋找出抑制大腸癌進(jìn)展的有效分子是十分有必要的。

DUSP2基因又名PAC-1，編碼一種DUSP，可使ERK1/2和p38 MAPK去磷酸化失活, 可以通過調(diào)節(jié)p53和E2F1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]，也可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤及控制炎癥的作用[9]。有研究顯示DUSP2可充當(dāng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫中的免疫監(jiān)查點，過表達(dá)的DUSP2使T細(xì)胞失去增殖和效應(yīng)能力并轉(zhuǎn)化為衰竭的T細(xì)胞[10]；在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，DUSP2被DNA甲基化下調(diào)，在T細(xì)胞活化過程中不被誘導(dǎo)，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化和促炎細(xì)胞因子的分泌[11]。DUSP2基因不僅在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，也參與其他疾病的病程，在腦動靜脈畸形中表達(dá)下調(diào)，這可能與MAPK參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)(細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞凋亡)等，在血管生成以及血管重塑的過程中發(fā)揮作用有關(guān)[12]。DUSP2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DUSP2在卵巢漿液性癌的滲出液細(xì)胞中上調(diào)[13]，在其他實體瘤中的水平卻顯著降低(如乳腺癌、大腸癌、肺癌、卵巢癌、腎癌和前列腺癌)，而DUSP2的降低會導(dǎo)致ERK磷酸化時間延長和耐藥性增加，如敲低DUSP2能減弱CRC對5-氟尿嘧啶的敏感性[14-15]。DUSP2的丟失還與一些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，例如低水平DUSP2的膀胱癌患者的預(yù)后顯著較差，漿液性卵巢癌患者中DUSP2表達(dá)下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤分期顯著相關(guān)，是患者生存的獨立危險因素[16-17]。先前的研究也表明缺氧能夠下調(diào)DUSP2介導(dǎo)誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞[18]。這表明DUSP2的功能可能像抑癌藥一樣，抑制DUSP2可以促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展。

本研究雖然未發(fā)現(xiàn)DUSP2表達(dá)與CRC患者的預(yù)后有關(guān)，但通過體外細(xì)胞劃痕試驗及細(xì)胞遷移試驗發(fā)現(xiàn)，DUSP2的敲低能使SW480細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，且CCK-8細(xì)胞增殖試驗也顯示DUSP2的下調(diào)使SW480細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。由此推測DUSP2表達(dá)上調(diào)可有效抑制CRC癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。MAPK級聯(lián)是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程的關(guān)鍵信號通路，包括增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng), 通過磷酸化調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子的活性，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，影響細(xì)胞的特異性生物學(xué)效應(yīng)[19-20]，其中ERK與p38的磷酸化激活正是其中的重要部分。通過western blot分析DUSP2下調(diào)對ERK和p38的磷酸化水平的影響，結(jié)果顯示其磷酸化水平升高，這說明DUSP2能夠通過調(diào)控MAPK通路來抑制腫瘤的進(jìn)展。在漿液性卵巢癌中，已經(jīng)證實通過抑制MAPK通路的磷酸化可以扭轉(zhuǎn)DUSP2下調(diào)所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖和遷移[17]。p53是介導(dǎo)細(xì)胞對DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵因素，PRAP1作為p53的靶基因能夠調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的細(xì)胞對基因毒性藥物的細(xì)胞毒性反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯來保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[21]。實驗組PRAP1蛋白水平高于對照組，說明敲低DUSP2能增強(qiáng)癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力，從而抑制癌細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果驗證了DUSP2基因很可能作為抑癌基因之一，在SW480細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵的作用。

總而言之，DUSP2在CRC的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用，且有可能成為其預(yù)測指標(biāo)，并作為一種抑癌基因為CRC的診治提供指導(dǎo)。