劉偉強，符洋

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 胃腸外科，河南 鄭州 450052)

結(jié)直腸癌是國內(nèi)外常見的惡性腫瘤之一，也是目前惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[1-2]。既往文獻統(tǒng)計結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌在男性中是第三常見的惡性腫瘤，在女性中是第二常見的惡性腫瘤，發(fā)病率分別占全球惡性腫瘤總患病人數(shù)的10%和9.2%[3]。近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)生逐漸出現(xiàn)年輕化的趨勢，可能與遺傳因素、不良的飲食和生活習慣有關(guān)，此類患者的預后相對更差[4]。目前治療結(jié)直腸癌的手段以手術(shù)聯(lián)合化療、放療、免疫治療的綜合治療為主。隨著蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組學、單細胞組學等高通量技術(shù)的發(fā)展，臨床對結(jié)直腸癌的生物學行為和發(fā)展有了更深的理解，但結(jié)直腸癌的治療效果仍欠佳，患者的預后仍然較差，迫切需要尋找更加有效的生物標志物和治療靶點。因此，深入探討結(jié)直腸癌中分子水平的變化及其機制，對更好地理解結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義，也有助于精準治療的發(fā)展。蛋白質(zhì)組學是一種利用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的手段，根據(jù)質(zhì)荷比測定細胞、組織或其他樣本中蛋白質(zhì)相對含量的高通量測序手段[5]。由于蛋白質(zhì)組學具備高通量、精準、快速的優(yōu)點，目前被廣泛用來測定生物樣本中的蛋白質(zhì)含量。近些年來，依托于蛋白質(zhì)組學技術(shù)，越來越多的研究瞄準腫瘤中蛋白質(zhì)表達的變化，同時結(jié)合生物信息學手段對腫瘤組織進行深入的分子分型及藥物靶點預測，極大地提升了對惡性腫瘤的認知。本研究旨在利用蛋白質(zhì)組學結(jié)合組織芯片探討結(jié)腸癌中蛋白質(zhì)表達的變化，并利用生物信息學方法分析腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(neuron-derived neurotrophic factor，NENF)與臨床因素及患者預后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源選擇2019年10月至2020年3月病理確診為結(jié)腸腺癌且未進行術(shù)前化療的10對癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，做好標記放入液氮儲存(樣本信息見表1)。另選擇2008—2015年手術(shù)后的結(jié)腸癌患者，通過電話等隨訪，收集臨床病理數(shù)據(jù)，篩選具有完整隨訪記錄和病歷信息的75例癌組織和63例癌旁正常組織制作組織微陣列。將總生存時間作為觀測終點。本研究所使用的生物樣本均已經(jīng)獲得鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

表1 結(jié)腸癌蛋白質(zhì)組學樣本基線資料

1.2 主要儀器和試劑高分辨軌道阱液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀( Q-Exactive HF-X)購于賽默飛公司；E2695高效液相色譜儀購自沃特世；研磨機器購自于上海凈信；4 ℃離心機購于艾本德公司；制冰機購于松下；鼠NENF多克隆抗體購于艾博抗 Abcam(上海)貿(mào)易有限公司；抗鼠 IgG 二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 蛋白質(zhì)組學相關(guān)實驗方法

1.3.1蛋白提取 從-80 ℃冰箱中取出組織樣本放置于冰上，使用滅菌后的組織剪剪取組織，并稱量約30 mg。用預冷過的磷酸緩沖鹽溶液洗滌組織2～3次。剪碎組織，加入600 μL ripa裂解液。在離心管中加入3.2 mm的研磨珠3粒及1.0 mm的研磨珠6粒，置于組織研磨儀中。研磨儀參數(shù)設(shè)置為：頻率65 Hz，運行30 s，2次，每次間隔10 s。在冰上裂解30 min。之后8 000 r·min-1離心20 s，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；4 ℃下離心，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液移入新的離心管中。將5倍體積的預冷丙酮加入離心管中，渦旋混勻60 s，然后置于-80 ℃冰箱沉淀60 min。取出離心管，4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min后棄上清液，加入500 μL預冷的80%(體積分數(shù))丙酮洗滌沉淀2次，棄上清液并吸盡殘留丙酮。然后加200 μL的25 mmol·L-1碳酸氫銨溶液，渦旋60 s后，冰浴超聲40 min，使蛋白沉淀，充分溶解。使用碧云天試劑盒并按照試劑盒說明書采用BCA法測定蛋白濃度。

1.3.2蛋白酶解 將提取的蛋白移出120 μg進行酶切，按總蛋白∶胰酶= 50∶1加入胰蛋白酶，混勻后，延離心管口緩慢吹入氮氣，置于混勻儀上，調(diào)整溫度為37 ℃，頻率為700 r·min-1，持續(xù)酶切12 h。然后按100∶1加入胰酶，37 ℃震蕩二次酶切，時間為2 h。使用C18小柱將多肽脫鹽。

1.3.3肽段分級 使用反向高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對肽段進行分級，將樣本分為10個餾分。流速為每分鐘0.5 mL。收集流出液，收集第1～56 min之間的餾分，共56管，按照間隔10個餾分合瓶的順序進行合瓶，如2-12-22-32-42-52合為1瓶。打開凍干機凍干肽段，后儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.4質(zhì)譜檢測 使用Easy-nLC 1200納升級液相色譜儀作為液相與Thermos Q Exactive HF-X-Orbitrip液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀進行數(shù)據(jù)采集。流動相A相為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水，B相為體積分數(shù)為80%的乙腈。使用數(shù)據(jù)依賴的采集模式采集質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)。采用高能碰撞解離方式進行離子碎裂，設(shè)置碎裂能量為28%。掃描范圍為350～2 000 m·z-1。然后選取相對數(shù)量排名前25位的母離子再次碎裂，二級質(zhì)譜掃描的質(zhì)量分析器同樣使用離子阱，分辨率為15 000，最大離子注入時間為45 ms。設(shè)置閾強度為5×104，設(shè)置動態(tài)排阻為50 s，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。

1.3.5數(shù)據(jù)搜庫和差異分析 將原始數(shù)據(jù)導入到蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)2.4(Proteome Discovery 2.4，PD 2.4)軟件中，結(jié)合從Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中下載的人類蛋白質(zhì)比對數(shù)據(jù)庫，利用PD內(nèi)置的SEQUEST算法進行蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)的搜庫。參數(shù)設(shè)置：組成肽段的氨基酸數(shù)目超過6個，只允許最多2個漏切位點，母離子的質(zhì)量容差為10 ppm(1 ppm=10-6)，碎片離子的質(zhì)量容差為20 ppm(1 ppm=10-6)，設(shè)置甲硫氨酸氧化和N端乙酰化修飾為可變修飾。FDR值為1%。對10對結(jié)腸癌組織與癌旁組織進行配對Student’st檢驗分析兩組蛋白質(zhì)表達的差異，定義對數(shù)轉(zhuǎn)化后的差異倍數(shù)(log2FC)>1且P<0.05為上調(diào)蛋白，而log2FC<-1且P<0.05為下調(diào)蛋白。

1.3.6差異蛋白注釋及功能富集分析 利用偏最小二乘判別法(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)將樣本所包含的大量蛋白質(zhì)表達量信息降維為少數(shù)幾個互相無關(guān)的主成分，以進行樣本間的比較。利用g:profiler(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/convert)數(shù)據(jù)庫進行基因本體(gene ontology，GO)分析，根據(jù)基因的分子功能、細胞成分及定位、可能參與的生物學過程將差異蛋白的信息對差異蛋白進行注釋。應(yīng)用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對差異基因進行富集分析。借助蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(https://www.proteomaps.net/)分析差異蛋白的富集權(quán)重。其中不同區(qū)域代表蛋白質(zhì)豐度，大小代表加權(quán)，模塊越大代表權(quán)重越大[6]。

1.4 公共數(shù)據(jù)庫下載分析分別下載了癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)中的結(jié)腸癌mRNA表達數(shù)據(jù)，包括GSE20970、GSE83889、GSE39582。提取各個數(shù)據(jù)集中NENF的mRNA表達量，并用t檢驗分析NENF在結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織中的表達差異。同時利用GSE17536中的預后數(shù)據(jù)，使用log-rank檢驗NENF的表達異常對患者無病生存時間的影響。利用KMplot數(shù)據(jù)庫分析NENF在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移組織、癌組織和癌旁組織中的表達差異。

1.5 組織微陣列制作及分析將138例樣本放置在體積分數(shù)為10%的甲醛中固定，后將標本分別浸入體積分數(shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇中，按順序依次脫水處理。利用二甲苯與無水乙醇混合液、純二甲苯進行透明化處理。用液體石蠟包埋制作蠟塊，最后使用組織微陣列點樣儀連續(xù)切片，并設(shè)置切片厚度為4 μm，隨后放置在烘干機烤片。按照抗體說明書對抗體進行適當?shù)南♂?，然后將切片置于二甲苯、梯度酒精、抗原修復盒中，? ℃環(huán)境下完成抗體孵育過夜，低鉀3，3N-二氨基苯胺四氫氯化物(3，3N-diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB)液顯色后，在顯微鏡下觀察并掌握染色程度。使用組織切片數(shù)字掃描儀采集免疫組化切片上的圖像，利用賽維爾圖像分析系統(tǒng)自動讀取組織測量區(qū)域，并計算出組織化學評分。此方法將每張切片內(nèi)陽性數(shù)量及其染色強度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，達到對組織染色半定量的目的。組織化學評分數(shù)值越大，說明綜合陽性強度越強[7-8]。

1.6 統(tǒng)計分析及可視化使用R-4.03或者Grahpad 8.3進行數(shù)據(jù)分析和作圖。對于兩組連續(xù)變量之間的比較使用配對或者非配對student’st檢驗；對于兩組以上的數(shù)據(jù)比較使用Kruskal-Wallis檢驗方法。在組織微陣列數(shù)據(jù)中以NENF表達中位數(shù)分組，采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，評估其高低表達對患者總生存時間的影響，采用log-rank進行統(tǒng)計學檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)組學蛋白鑒定及差異分析結(jié)果本研究利用10對結(jié)腸癌組織進行蛋白質(zhì)組學測序，共鑒定得到10 809種蛋白質(zhì)。進一步過濾掉在總體樣本中表達缺失值>30%的蛋白質(zhì)后，納入9 695種蛋白質(zhì)進行后續(xù)分析。根據(jù)質(zhì)譜蛋白數(shù)據(jù)，PLS-DA分析顯示，結(jié)腸癌組織樣本和癌旁組織之間蛋白質(zhì)表達譜有一定差異(圖1A)。進一步利用配對t檢驗進行癌組織與癌旁組織的差異蛋白分析，以差異倍數(shù)|log2FC|>1同時P<0.05作為差異的標準，最后總共鑒定出429種差異表達蛋白，其中333種在結(jié)腸癌組織中上調(diào)，96種在結(jié)腸癌組織中下調(diào)。根據(jù)差異倍數(shù)，排名前10位的上調(diào)蛋白有：CRABP1、NSRP1、ABHD17C、GLYCTK、HLA-DRB1、CBLB、SEMA4D、SPIRE1、ATF7、KRT4(表2)。同時繪制火山圖展示差異蛋白結(jié)果(圖1B)。

表2 上調(diào)倍數(shù)前10位的差異蛋白

2.2 上調(diào)蛋白的GO分析在生物學過程中，結(jié)腸癌組織樣本主要與細胞大分子代謝、對外界刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)代謝、rRNA代謝、細胞代謝調(diào)節(jié)等相關(guān)。細胞內(nèi)定位和成分分析結(jié)果顯示，上調(diào)蛋白主要分布在細胞質(zhì)、細胞核、內(nèi)膜系統(tǒng)。在分子功能方面，上調(diào)蛋白主要與蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、磷脂酰肌醇磷酸5-磷酸酶活性、催化活性等功能相關(guān)。見圖2。

2.3 差異蛋白注釋及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析利用蛋白質(zhì)圖譜描繪在結(jié)腸癌組織樣本中高表達蛋白質(zhì)的分布發(fā)現(xiàn)，上調(diào)蛋白主要與信號轉(zhuǎn)導、折疊排列和降解、轉(zhuǎn)錄、生物合成、信號分子相互作用、免疫系統(tǒng)相關(guān)(圖3A)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)蛋白主要與轉(zhuǎn)錄因子、MAPK信號通路、剪切體、脂質(zhì)和類固醇代謝等通路相關(guān)(圖3B)。KEGG分析顯示，上調(diào)的蛋白主要富集的通路包括癌癥相關(guān)通路、PI3K-AKT信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、磷脂酶D信號通路、mTOR信號通路、MAPK信號通路(圖3C)。

A為生物學功能；B為細胞內(nèi)定位；C為分子功能。

A、B為蛋白質(zhì)圖譜富集結(jié)果； C為KEGG富集結(jié)果。

2.4 NENF在結(jié)腸癌中的表達及蛋白質(zhì)互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析為了分析結(jié)腸癌中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，進一步對比了10個癌組織樣本中周圍神經(jīng)侵犯陽性(5例)和周圍神經(jīng)侵犯陰性組(5例)中差異表達的蛋白。NENF在周圍神經(jīng)侵犯陽性癌組織中表達升高(P<0.05)(圖4A)。既往有研究表明周圍神經(jīng)侵犯可能與腫瘤細胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子的異常升高有關(guān)[9]。NENF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子樣的生長因子。NENF在肝癌中異常升高，體外實驗顯示沉默NENF會引起抑制肝癌細胞的惡性生物學行為[10]。NENF在結(jié)腸癌組織中表達量升高(P<0.05)(圖4B)。利用STRING分析與NENF相互作用的分子，結(jié)果顯示，CYB5A、EM206、FOXRED2、LARP1B、PCYOX1等與NENF相關(guān)(圖4C)，具體相關(guān)性得分見表3。

表3 與NENF相關(guān)的基因

2.5 公共數(shù)據(jù)庫分析NENF在結(jié)腸癌中的表達NENFmRNA的表達在結(jié)腸癌組織中升高(P<0.05)(圖5)。在GSE39582隊列中，Ⅰ～Ⅳ期NENFmRNA的表達量均高于癌旁組織(P<0.05)(圖6)。進一步使用KMplot數(shù)據(jù)庫中的大隊列、多中心的數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示NENF在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移組織中的表達高于結(jié)腸癌組織和癌旁組織(P<0.05)(圖7)。結(jié)合自測的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中NENF的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平均異常升高，在轉(zhuǎn)移組織中表達量更高。從GSE17536隊列中提取NENF的表達量和患者無病生存期信息，利用Kaplan-Meier分析NENF的表達與結(jié)腸癌患者無病生存期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NENF高表達與結(jié)腸癌患者較短的無病生存期相關(guān)(HR為2.41，95% CI：1.24～4.69，P<0.05)(圖8)。

A、B、C、D為NENF mRNA在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達情況，數(shù)據(jù)庫包括GSE20970(A)、GSE83889(B)、GSE39582(C)、TCGA(D)。

2.6 結(jié)腸癌組織芯片中NENF蛋白表達分析為了進一步分析NENF在結(jié)腸癌中的表達及其對患者預后的影響，選取138例結(jié)腸癌樣本制作組織微陣列，其中癌組織75例，癌旁組織63例。癌組織及癌旁正常組織的染色結(jié)果如圖9，結(jié)果顯示NENF在結(jié)腸癌組織中的表達量更高。對癌組織及癌旁組織中NENF的表達進行差異分析，結(jié)果顯示NENF在腫瘤組織中的表達量高于癌旁對照組織(P<0.05)(圖10A)。進一步分析不同臨床分期中NENF的表達量變化，結(jié)果顯示，Ⅳ期患者NENF的表達量較Ⅱ期或者Ⅲ期的患者高(圖10B)。結(jié)合對應(yīng)的生存狀態(tài)和生存時間數(shù)據(jù)，以NENF表達量的中位數(shù)分組，表達量大于中位數(shù)的為高表達組，小于中位數(shù)為低表達組。利用Kaplan-Meier分析NENF的表達對患者預后的影響，結(jié)果顯示，NENF高表達患者的總生存時間更短(HR為2.19，95% CI：1.07～4.48，P<0.05)。見圖11。

圖6 GSE39582數(shù)據(jù)集中NENF的表達與臨床分期之間的關(guān)系

圖7 KMplot數(shù)據(jù)庫NENF在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移組織、癌組織和 癌旁正常組織間的表達差異

圖8 GSE17536數(shù)據(jù)集中NENF的表達異常對患者 無病生存期的影響

DAB染色，100×。

A.NENF在癌組織和癌旁組織的表達差異；NENF在不同分期癌組織中的表達差異。

圖11 NENF表達與患者預后的生存分析

3 討論

結(jié)腸癌是一種全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均較高的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病趨于年輕化。晚期結(jié)腸癌的生存率不足8%[11-12]。因此，深入探討結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機制對結(jié)腸癌的診斷、預后評估及治療具有重要意義。

本研究利用蛋白質(zhì)組學分析結(jié)腸癌組織中蛋白質(zhì)表達的變化，并利用生物信息學分析結(jié)腸癌組織中富集到的信號通路，對更深入理解結(jié)腸癌發(fā)生、進展中的分子變化提供了有力的證據(jù)。對比分析結(jié)腸癌組織與癌旁組織中蛋白質(zhì)表達的差異，發(fā)現(xiàn)在癌組織中上調(diào)的蛋白質(zhì)有333種，部分蛋白質(zhì)在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。既往文獻報道血小板衍生生長因子B可以促進結(jié)腸癌血管增生，并促進結(jié)腸癌細胞的增殖和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生[13-14]。異常高表達PIK3CD可以激活AKT通路，促進結(jié)腸癌細胞的生長和侵襲[15-17]。結(jié)直腸癌中肝細胞生長因子異常上調(diào)與患者較差的預后有關(guān)[18]。在差異蛋白富集方面，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中富集的通路主要有PI3K-AKT、磷脂酰肌醇、磷脂酶D、mTOR、MAPK等信號通路。既往文獻報道磷酸肌醇3-激酶的活性異常會引起下游AKT的異常激活，從而影響細胞的生長、發(fā)育等表型，其異常激活在胃癌、肝癌、乳腺癌、腦癌等多種癌癥中發(fā)揮重要作用[15,17,19-20]。本研究結(jié)果提示激酶表達增多、相關(guān)通路異常激活在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。針對這些分子和通路的靶點和藥物的開發(fā)對結(jié)腸癌的個體化治療具有重要意義。

NENF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元發(fā)育和脂肪細胞的分化中起作用[21-23]。近些年來逐漸有研究報道NENF參與多種實體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。Koper-Lenkiewicz等[24]報道血漿或者腦脊液中NENF的表達可以作為識別腦癌的重要標志物。Han等[25]發(fā)現(xiàn)NENF在乳腺癌中高表達，且其通過激活MAPK和PI3K信號通路促進乳腺癌的進展。本研究結(jié)果顯示，NENF在結(jié)腸癌組織中異常高表達，且在神經(jīng)侵犯陽性組的表達更高。結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進一步證實了NENF在結(jié)腸癌中mRNA和蛋白質(zhì)水平均異常高表達。最后利用結(jié)腸癌組織芯片分析NENF蛋白水平的表達，再次驗證NENF在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)高表達，且在較高的臨床分期中表達量更高。生存分析顯示，NENF高表達患者的總生存時間較短，預后較差。Stefanska等[10]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，NENF通過激活MAPK或PI3K-AKT信號通路促進肝癌細胞、膽囊癌細胞和乳腺癌的生長和侵襲等惡性生物學行為。故推測NENF可能通過激活PI3K-AKT信號通路促進結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究利用蛋白質(zhì)組學和組織芯片技術(shù)揭示了結(jié)腸癌組織中蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)并驗證了NENF在結(jié)腸癌中異常高表達，證明其高表達與患者的預后不良明顯相關(guān)。NENF有望成為預測結(jié)腸癌預后的標志物和潛在的治療靶點。