石林林，郝思妤，李佳怡，喻 瑩，史嘉銘，高社干,2

食管癌是消化道腫瘤中具有侵襲性和致命性的惡性腫瘤之一，是全球范圍內導致癌癥患者死亡的第六大原因[1]。中國作為食管癌高發(fā)國家，約占全球每年新發(fā)病例的54.1%、死亡病例的56%,其中河南省是全球食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[2-4]。目前，食管癌的標準治療方案包括手術、放化療以及靶向治療等多學科方法，但患者的總體預后仍不理想，5 a總生存率僅為30%～40%，嚴重危害人民健康[5]。因其病因及演進機制不明，導致國內外至今在早期診療和精準防治方面尚未取得關鍵性突破，成為困擾食管癌領域科學研究的難點問題。與此同時，食管癌目前缺乏有效的臨床前模型來研究其惡性演進機制，以高效準確地預測患者的藥物敏感度，實現(xiàn)患者的個體化精準醫(yī)療[6-7]。細胞培養(yǎng)從傳統(tǒng)液體培養(yǎng)到三維的轉變是模擬人體內部微環(huán)境的關鍵環(huán)節(jié)，三維模型比傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)環(huán)境能更好地重現(xiàn)體內復雜的微環(huán)境[8-10]。與傳統(tǒng)二維單層培養(yǎng)技術相比，腫瘤類器官技術實現(xiàn)了腫瘤生長過程的可視化，提供了腫瘤干細胞克隆動態(tài)和可塑性的研究方法，為尋找腫瘤治療的潛在靶點提供了新的途徑[11-14]。

本研究將微纖維生物復合水凝膠和細胞自組裝相結合，構建可負載食管癌類器官來源單細胞懸液的新型光固化生物復合水凝膠。通過對微流控芯片雙層同軸流體的精準調控，制備含有水凝膠的中空食管仿生微纖維材料，將其作為食管癌類器官的3D生物載體?；隗w外3D細胞培養(yǎng)技術，在三維體系中構建食管癌類器官模型，結合微流控技術，可較好地維持腫瘤異質性，保留腫瘤局部復雜微環(huán)境的影響，為食管癌發(fā)病機制研究、患者藥物療效檢測提供技術保障，為食管癌患者個體化精準醫(yī)療方案的制定奠定基礎。現(xiàn)報道如下。

1 材料方法

1.1 甲基丙烯酸酐化明膠的制備依次將20 g明膠和10 g無水碳酸鈉在50 ℃充分溶解到200 mL超純水中，倒入裝有轉子的錐形瓶，在50 ℃熱水浴中攪拌直至完全溶解。將4 mL甲基丙烯酸酐緩慢滴加到錐形瓶中，滴加時間控制在2 min。將上述溶液在50 ℃熱水浴中持續(xù)攪拌1 h，其間每10 min用10%(w/v)的氫氧化鈉調節(jié)pH至9.0，滴加5次，約需要20 mL氫氧化鈉。將上述混合初品在50 ℃熱水浴下透析，每2 h換一次水，換水至少20次，將透析產(chǎn)物放在-20 ℃冰箱預凍2 h后再真空干燥5 d。

1.2 毛細管微流控裝置的搭建該部分使用的微流控裝置是由兩根玻璃毛細圓管和一根方管同軸排列在載玻片上構建而成。玻璃毛細圓管的內徑和外徑分別為600 μm和1 mm。其中一根玻璃毛細圓管首先由拉針儀拉細，然后經(jīng)燒針器將尖端直徑截至300 μm。該一端為300 μm的玻璃毛細圓管作為內相注入管置于載玻片左側，另一根玻璃毛細圓管被截至45 mm長作為出口置于載玻片右側。兩根圓管同軸插入方管并用環(huán)氧樹脂膠固定約6 h，即完成微流控裝置的搭建。為使內外相形成穩(wěn)定的層流，內外相的流速設置為0.4 mL·h-1和2 mL·h-1。

1.3 食管鱗癌類器官的構建將類器官完全培養(yǎng)液(RPMI1640基礎培養(yǎng)基+100 ng·mL-1Noggin+200 ng·mL-1R-spondin-1+10 μg·mL-1Gentamicin+50 ng·mL-1EGF)在冰上進行預冷，調整食管鱗癌細胞濃度至1×105·mL-1。然后將Matrigel與細胞懸液以1∶9體積充分混合后置于冰上，每孔300 μL滴入提前預冷好的24孔培養(yǎng)板。種板后將培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱60 min。當Matrigel充分固化之后，沿培養(yǎng)板壁緩慢加入1 mL食管鱗癌類器官完全培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng)板置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內，CO2濃度5%，37 ℃靜置培養(yǎng)，每隔5 d更換一次培養(yǎng)液，于顯微鏡下觀察。

1.4 食管癌仿生類器官芯片的制備內相含有100 μL食管癌類器官消化得到的單細胞懸液(5×106個·mL-1)和10% PVA+0.1% CaCl2溶液作為逃逸材料，外相含NaAlg(2%)、GelMa(10%)和HMPP(1%)。所有溶液通過注射泵泵入微流控裝置，并在0.1%的CaCl2溶液中進行收集。當流體由出口流出時，在紫外線照射(365 nm、100 W)條件下，纖維進一步光交聯(lián)5 min，接著轉移入2% CaCl2加固2 min，最后用PBS洗兩遍，加入培養(yǎng)基，再在纖維表面滴加200 μL血管內皮細胞HUVEC懸液(5×106個·mL-1)，用培養(yǎng)基將固化后的負載細胞微纖維清洗兩遍，然后轉移至盛有完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。全程在無菌環(huán)境下操作，Alg-GelMa、CaCl2水溶液均經(jīng)0.22 μm無菌濾頭過濾除菌。

1.5 食管癌仿生中空纖維的形貌及功能表征將制得的食管癌仿生生物復合水凝膠單層中空載細胞微纖維用去離子水清洗一遍，然后浸泡在去離子水中用液氮快速冷凍，最后經(jīng)冷凍干燥完成制樣。用導電膠將其固定在載物臺上，將樣品放入真空離子濺射儀，經(jīng)噴金處理15 min后，放入掃描電子顯微鏡內固定，選取適當?shù)姆糯蟊稊?shù)，挑選合適的視野觀察樣品表面及截面形貌并拍攝。通過細胞活性實驗，分別測定單層中空纖維中食管癌細胞及常規(guī)液體培養(yǎng)環(huán)境中食管癌細胞的生長情況。

2 結果

2.1 單層中空食管仿生復合水凝膠纖維的制備及表征本研究通過搭建的微流控裝置，首先制備了食管仿生中空結構的微纖維，同時負載所構建的食管鱗癌類器官來源的細胞。如圖1所示，初步成功制備了具有光滑內壁結構的Alg-GelMa復合水凝膠單層中空微纖維，其管徑大小可以通過內外相流速加以控制。在掃描電子顯微鏡下觀察，如圖1A所示，上述中空微纖維截面的圓形空洞清晰可見，高倍鏡下還可以清楚地觀察到中空微纖維具有較厚的管壁，管壁呈多孔結構。將收集到的單層中空纖維在紫外光照條件下進行滅菌處理，并用培養(yǎng)基清洗后移至盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔板內，將食管癌類器官來源的3D腫瘤細胞球消化處理制備單細胞懸液，將細胞進行綠色熒光標記(Dio)之后接種于中空纖維中，食管癌細胞可以在纖維狀復合水凝膠中黏附生長(圖1B)。

A：單層中空仿生復合水凝膠纖維掃描電鏡圖(從左到右電鏡圖片倍數(shù)逐級放大)；

2.2 單層中空仿生復合水凝膠纖維的細胞負載和活性功能研究本研究初步構建的負載食管癌類器官來源腫瘤細胞的單層中空仿生復合水凝膠纖維如圖2A中所示。將腫瘤細胞進行綠色熒光標記，血管內皮細胞進行紅色熒光標記，將制備得到的食管癌類器官模型進行熒光染色共定位分析，結果如圖2B中所示。本研究制備的食管癌仿生類器官模型，其橫截面呈現(xiàn)單層中空結構，內層為食管癌細胞，外層為血管內皮細胞，較好地還原了患者的組織病理結構，且腫瘤細胞在3D模型中的生長情況與常規(guī)液體培養(yǎng)條件下差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，支持所構建的模型具有良好的生物相容性。

A：食管癌仿生類器官芯片3D建模示意圖(左：平視圖；右：縱切面示意圖)；

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因改變、多階段演進積累的復雜病理過程，建立不同階段的腫瘤模型是解析其發(fā)生發(fā)展分子機制的關鍵[15]。傳統(tǒng)液體培養(yǎng)條件簡單，易于體外擴增，但在培養(yǎng)過程中常丟失腫瘤異質性且無法重現(xiàn)體內復雜的微環(huán)境，而動物模型由于移植成功率低、種屬差異明顯、培養(yǎng)周期長以及成本高，難以大規(guī)模用于個體化的藥物篩選[16]。腫瘤類器官的出現(xiàn)很好地解決了上述問題，其高度概括了來源腫瘤組織的特征，較好地保留了原位腫瘤組織的生物學特征和個體之間的異質性，培養(yǎng)周期較短，且經(jīng)多次傳代后依然能保持基因組穩(wěn)定性，因而具有較高的轉化應用價值[17]。類器官能夠在一定程度上還原特定的細胞類型組成和真實器官的三維結構及功能，其作為研究干細胞命運調控、器官發(fā)生、疾病模型的前沿技術，已被作為關鍵性共性技術之一納入科技部“十四五”首批重點專項[18]。

本研究首次制備了一種簡便的雙層微流控系統(tǒng)，包括兩種可更換的流體和一個由玻璃毛細管同軸組裝而成的微流體裝置。通過該系統(tǒng)，使用生物相容性良好的復合水凝膠制備了具有單層中空結構的食管仿生微纖維。在此基礎上構建了食管癌類器官來源的3D仿生類器官芯片，后續(xù)可將其應用于研究食管癌的發(fā)生和發(fā)展過程、病原微生物誘發(fā)食管癌惡性演進的分子機制以及高通量的藥物療效篩選等，具有廣闊的應用前景。