李 揚(yáng)，楊 志，馬 英，任 靜

二尖瓣反流是左心室擴(kuò)張并在Starling機(jī)制下心搏量增加，并通過左心室向低壓左心房射血促進(jìn)心搏量增加[1]。盡管病人存在潛在的心肌細(xì)胞收縮障礙，這些有利于穩(wěn)定左室縮短動(dòng)力學(xué)，提高左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。因此，為了維持左室收縮功能和提高生存率，若病人LVEF<60%，建議進(jìn)行二尖瓣成形手術(shù)[2-3]。然而，二尖瓣修復(fù)后左室收縮功能下降是一個(gè)危險(xiǎn)因素，心肌細(xì)胞不可逆損傷機(jī)制尚未明確。目前，尚無有效的藥物可降低左心室重塑過程，而慢性二尖瓣反流病人特異性左心室心肌重塑機(jī)制尚未明確[4-6]。為了探討二尖瓣反流的分子特征，本研究分析左室功能異常二尖瓣反流病人MRI影像參數(shù)與肌脂蛋白(SLN)水平的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2019年2月在秦皇島第三醫(yī)院診治的50例二尖瓣反流病人為研究組、同期納入13名健康者為對(duì)照組，兩組均接受MRI影像檢查，嚴(yán)重單發(fā)性二尖瓣反流病人術(shù)前均行心導(dǎo)管插入術(shù)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.2 病人納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡25～76歲；繼發(fā)于二尖瓣退行性疾病的嚴(yán)重單發(fā)二尖瓣反流，建議二尖瓣矯成形手術(shù)的病人；經(jīng)超聲心動(dòng)圖/多普勒檢查證實(shí)為嚴(yán)重的單發(fā)性二尖瓣反流；均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 阻塞性冠狀動(dòng)脈疾病(冠狀動(dòng)脈狹窄>50%)；主動(dòng)脈瓣疾病或伴發(fā)二尖瓣狹窄的病人。

1.3 方法

1.3.1 心臟MRI 使用1.5T的MRI掃描儀(Sigma GE Healthcare，密爾沃基，WI)并優(yōu)化調(diào)試為心臟磁共振成像。通過計(jì)算左心室每個(gè)短軸切片集合的等高線輪廓總和確定體積[7-9]。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 二尖瓣反流樣本來源于研究組病人手術(shù)時(shí)的心肌組織材料，正常樣本由第三方實(shí)驗(yàn)室提供，制成5 μm厚度的石蠟切片后，在二甲苯溶液中脫蠟并在梯度稀釋的乙醇中水化恢復(fù)。使用含有5%正常血清封閉后，切片用SLN抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，1∶100稀釋)；室溫孵育1 h后，使用Alexa熒光偶聯(lián)的二抗(分子探針，Eugene，OR，1∶200稀釋)再次室溫孵育1 h。使用含DAPI的Vectashield Mounting培養(yǎng)基進(jìn)行核染色計(jì)數(shù)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。使用預(yù)裝Simple PCI軟件的徠卡DM6000熒光顯微鏡(Compix，Inc，Cranberry Township，PA)進(jìn)行圖像采集和熒光強(qiáng)度測量。圖像進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋尘盁晒庹{(diào)整。

1.3.3 免疫印跡法 總蛋白勻漿液來源于對(duì)照組正常組織樣本和二尖瓣反流病人組織樣本。3名健康者和4例二尖瓣反流病人左心室組織樣本在8%[SERCA2a和calsequestrin(CSQ)]或14% Tricine十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或16.5%甘油三醇凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。使用一抗(兔抗SLN為1∶3 000，兔抗SERCA2a為1∶5 000，抗兔CSQ為1∶500)，之后是hrp偶聯(lián)的二抗[10]。使用Super Signal West Dura底物(Pierce)檢測信號(hào)并用密度法定量并歸一化到CSQ表達(dá)水平。樣品緩沖液中的蛋白首先通過考馬斯亮藍(lán)染色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，分別對(duì)SERCA和SLN進(jìn)行免疫印跡法，使用相同的樣本，以CSQ和GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組與研究組臨床資料比較(見表1)

表1 對(duì)照組與研究組臨床資料比較

2.2 對(duì)照組與研究組MRI影像學(xué)參數(shù)比較(見表2)

表2 對(duì)照組與研究組MRI影像學(xué)參數(shù)比較(±s)

2.3 典型病例的左心室雙腔圖像(見圖1)

圖1 典型病例的左心室雙腔圖像

2.4 免疫印跡法定量檢測SLN表達(dá) 免疫印跡法檢測顯示，研究組SLN表達(dá)高于對(duì)照組。采用Super Signal West Dura底物(Pierce)檢測信號(hào)并用密度法定量并歸一化到CSQ表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，研究組SLN表達(dá)較對(duì)照組增加。詳見圖2。

圖2 兩組SLN蛋白表達(dá)比較(A為SLN蛋白免疫印記圖像；B為SLN蛋白表達(dá)柱狀圖)

2.5 SLN免疫熒光染色 SLN免疫熒光染色結(jié)果顯示，研究組SLN表達(dá)較對(duì)照組增高。對(duì)照組SLN染色信號(hào)強(qiáng)度為(245.87±20.51)，研究組為(2 570.32±513.36)，兩組比較差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見圖3。

圖3 兩組SLN免疫熒光染色比較(A為SLN的免疫熒光染色；B為SLN信號(hào)強(qiáng)度柱狀圖)

2.6 SLN免疫熒光染色強(qiáng)度與MRI影像學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析 對(duì)SLN免疫熒光染色強(qiáng)度MRI影像學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SLN免疫熒光染色強(qiáng)度(2 570.32±513.36)與LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球狀化指數(shù))、LVESD(球狀化指數(shù))呈正相關(guān)。詳見表3。

表3 SLN免疫熒光染色強(qiáng)度與MRI影像學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討 論

二尖瓣反流是臨床常見的心臟瓣膜疾病，病程進(jìn)展可能導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓、心力衰竭、心房顫動(dòng)等，嚴(yán)重者甚至死亡。SLN位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是由31個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，主要在骨骼肌、心肌細(xì)胞中表達(dá)[11]。有研究顯示，SLN參與乳腺癌等疾病的發(fā)生和發(fā)展，但其在心血管疾病中作用的研究較少[8，12]。SLN通常在心房中高表達(dá)，在心室中低表達(dá)或檢測不到[8]。SLN在正常和病變心肌的人類或動(dòng)物模型中作用差異尚不明確。

相關(guān)研究表明，SLN通過降低SERCA2a的Ca2+親和性，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[9-10]。Tako-Tsubo型心肌病病人中，SLN在功能失調(diào)的左心室出現(xiàn)急性表達(dá)升高，并在12 d恢復(fù)期后，LVEF恢復(fù)正常[13-14]。因此，二尖瓣反流病人心臟中SLN表達(dá)增加可能是腎上腺素驅(qū)動(dòng)增加的早期代償性改變。SLN心室表達(dá)是否有害尚未明確，雖然處于較低表達(dá)水平，但保持著基礎(chǔ)水平。

本研究結(jié)果顯示，研究組與對(duì)照組LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球狀化指數(shù))、LVESD(球狀化指數(shù))比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。典型二尖瓣反流病人左心室雙腔圖像顯示明顯的左室擴(kuò)張和心室壁變薄。通過MRI測定心室體積，病人左心室重塑程度是一致的。

本研究免疫印跡法定量檢測發(fā)現(xiàn)，研究組SLN表達(dá)染色信號(hào)強(qiáng)度高于對(duì)照組，同時(shí)免疫熒光染色結(jié)果顯示，研究組SLN蛋白表達(dá)較對(duì)照組增高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)二尖瓣反流病人SLN表達(dá)上調(diào)，通常認(rèn)為是心房肌細(xì)胞特異性SERCA的調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)單發(fā)二尖瓣反流病人左心室功能方面具有重要的意義。本研究對(duì)SLN免疫熒光染色強(qiáng)度與影像學(xué)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SLN免疫熒光染色強(qiáng)度與LVEDV、LVESV、LVSV、LVMI、LVEDD、LVESD、LVEDD(球狀化指數(shù))、LVESD(球狀化指數(shù))呈正相關(guān)。

綜上所述，SLN作為關(guān)鍵的心房調(diào)節(jié)因子在左室功能異常二尖瓣反流病人中顯著上調(diào)，且與MRI影像學(xué)參數(shù)具有相關(guān)性，可填補(bǔ)關(guān)于超負(fù)荷體積導(dǎo)致的心臟功能失調(diào)過程，尤其在腎上腺素增加的單發(fā)二尖瓣反流病人SLN表達(dá)。