王 微， 梅世慧， 陳江鳳， 陳 超， 周碧君，2，3， 文 明，2，3

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點試驗室；貴州貴陽 550025；3.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州貴陽 550025）

1 材料與方法

1.1 主要材料 產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis，C.u）與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，L.p），購自上海保藏生物科技有限公司； 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.c）、 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，B.l）、 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis，B.s）、短 小 芽 孢 桿 菌（Bacillus pumilus，B.p）與糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.f），由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室提供。 紅薯，購自貴州惠民生鮮超市。 YPD 培養(yǎng)基，購自北京百奧萊博科技有限公司；普通營養(yǎng)培養(yǎng)基，購自杭州微生物試劑有限公司；MRS 培養(yǎng)基， 購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 BD53 恒溫培養(yǎng)箱 （德國賓得公司），QYC-2102C 恒溫搖床（上海新苗醫(yī)療器械制造公司），K9860 全自動凱氏定氮儀 （海能未來技術集團股份有限公司），WA-003 破壁榨汁機 （潁上力程儀器設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵底物制備 紅薯洗凈切塊， 放入榨汁機打碎，三層紗布過濾，放入白瓷盤，置于60 ℃烘箱，20 min 攪拌一次，2 h 取出， 置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 益生菌復蘇及種子液制備 無菌環(huán)挑取菌種接種相應培養(yǎng)基（酵母菌接種YPD 培養(yǎng)基、乳酸菌接種MRS 培養(yǎng)基、 芽孢桿菌接種普通營養(yǎng)培養(yǎng)基），酵母菌30 ℃、乳酸菌和芽孢桿菌37℃恒溫培養(yǎng)24 h；挑取單個菌落接種相應液體培養(yǎng)基，恒溫搖床（180 r/min）培養(yǎng)12 h，取3 mL菌液接種相應100 mL 液體培養(yǎng)基中， 恒溫搖床（180 r/min）培養(yǎng)24 h 取出種子液；采用平板稀釋涂布法測定種子液菌液濃度，用滅菌水稀釋至1×109cfu/mL，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.3 益生菌拮抗試驗 取益生菌種子液， 分別劃線于YPD 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基與普通營養(yǎng)培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察生長情況，篩選均適宜7 株益生菌生長的培養(yǎng)基； 再取7 種益生菌劃線，觀察拮抗性。

1.3.4 基于粗蛋白質產(chǎn)物菌株篩選 參考歐榮娣等（2015）方法，按3%（V/m）接種量，將產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、釀酒酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌與糞腸球菌菌液接種于100 g 紅薯渣中，30 ℃恒溫發(fā)酵3 d 取出，60 ℃烘干恒重，通過國標GB/T 6432-2018 測定粗蛋白質含量，以粗蛋白質含量為指標進行益生菌菌株篩選。

1.3.5 復合益生菌固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

第五孔窯洞開間3.28m，進深7m，室內(nèi)空間狹長，此處是裝載糧食的空間，南側設窗但不設門，進入此處只能通過第四孔窯洞，這樣既保證了室內(nèi)的通風采光，使糧食的存放時間更長，也保證了糧食的存放安全，避免了外來人直接進入糧食裝載區(qū)。

1.3.5.1 單因素試驗 以粗蛋白質含量高的4 種益生菌以1：1：1：1 混合， 于0%、1%、3%、5%、7%和9%（V/m）接種量接種100 g 紅薯渣，30 ℃恒溫發(fā)酵3 d 取出，測定粗蛋白質含量，篩選出最佳菌液接種量。 以最佳接種量接種8 袋紅薯渣，30 ℃恒溫發(fā)酵，于0、1、2、3、4、5、6 d 和7 d 取出，測定粗蛋白質含量。

1.3.5.2 正交試驗 采用L9（34）正交試驗設計，以粗蛋白質含量為指標，根據(jù)單因素試驗結果以最佳接種量和最佳發(fā)酵時間前后兩個值， 與發(fā)酵溫度（28、30、32 ℃）進行正交試驗。

1.3.6 紅薯渣最佳發(fā)酵條件驗證 根據(jù)上述篩選得到的最佳條件（益生菌菌種、接菌量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度）進行發(fā)酵，以粗蛋白質含量為指標驗證。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 上述試驗均設三個重復，檢測結果數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進行分析， 以 “平均值±標準差” 表示， 其中P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 益生菌拮抗試驗結果 酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌在YPD 培養(yǎng)基生長：7 種益生菌拮抗試驗結果如圖1， 其中產(chǎn)朊假絲酵母與枯草芽孢桿菌拮抗， 植物乳桿菌與短小芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌、 枯草芽孢桿菌拮抗， 糞腸球菌與短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌拮抗。

圖1 益生菌拮抗性試驗結果

2.2 基于粗蛋白質含量菌種篩選結果 7 種益生菌發(fā)酵紅薯渣中粗蛋白質含量變化結果見表1；由高至低順序分別為： 產(chǎn)朊假絲酵母＞地衣芽孢桿菌＞植物乳桿菌＞釀酒酵母＞糞腸球菌＞枯草芽孢桿菌＞短小芽孢桿菌， 較未發(fā)酵紅薯渣顯著提高29.92% 、25.76% 、15.51% 、14.40% 、11.63% 、5.54%、1.11%（P＜0.05）。 根據(jù)拮抗試驗植物乳桿菌與地衣芽孢桿菌拮抗，因此添加產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌（1：1：1：1）復合發(fā)酵。

表1 7 種益生菌發(fā)酵紅薯渣中粗蛋白質含量%

2.3 復合益生菌固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗 添加產(chǎn)朊假絲酵母、 釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌（1：1：1：1）混合菌液，于不同接種量發(fā)酵， 紅薯渣中粗蛋白質含量變化結果見圖2； 粗蛋白質含量隨菌液接種量的增加先升高后下降。 以最佳接種量5%進行不同時間發(fā)酵，結果見圖3；粗蛋白質含量隨時間延長先上升后下降，最佳發(fā)酵時間為4 d。

圖2 不同接種量粗蛋白質含量

圖3 不同發(fā)酵時間粗蛋白質含量

2.3.2 正交試驗結果分析 以粗蛋白質含量為指標， 根據(jù)單因素試驗結果最佳接種量和最佳發(fā)酵時間前后兩個值 （3、4、5 d） 和 （3%、5%、7%），與發(fā)酵溫度（28、30、32 ℃）進行正交試驗，因素水平組合見表2。正交試驗結果見表3，3 個因素主次順序為C＞B＞A；最佳發(fā)酵條件為A1B3C3， 即發(fā)酵時間3 d， 菌液接種量7%， 溫度32℃。 正交試驗方差分析結果見表4，表明A、B、C 3 個因素對提高發(fā)酵紅薯渣中粗蛋白質影響差異均不顯著。

表2 紅薯渣發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平

表3 紅薯渣固態(tài)發(fā)酵工藝條件L9（34）正交試驗結果與分析

2.4 紅薯渣最優(yōu)發(fā)酵條件驗證 于最佳發(fā)酵條件添加產(chǎn)朊假絲酵母+釀酒酵母+植物乳桿菌+糞腸球菌（1：1：1：1）混合菌液，接種量7%、32 ℃發(fā)酵3 d，測定粗蛋白質含量進行驗證，結果見圖4；較未發(fā)酵紅薯渣中粗蛋白質顯著提高39.27%（P＜0.05），與正交試驗No.2 條件發(fā)酵紅薯渣中粗蛋白質含量（4.47±0.056）（P＞0.05）差異不顯著，表明紅薯渣最優(yōu)發(fā)酵條件可行。

圖4 最優(yōu)發(fā)酵條件粗蛋白質含量變化

3 討論

紅薯渣由于水分過多難以保存與利用， 烘干成本高且破壞紅薯渣中酚類化合物與胡蘿卜素等成分。 Shen 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，利用益生菌發(fā)酵紅薯渣可延長保存時間、改善風味、保留胡蘿卜素以及酚類物質。Shivashankara 等（2004）研究表明，益生菌發(fā)酵紅薯渣能夠有效提高抗氧化酚、 脂肪酸和植物固醇含量， 其中抗氧化酚可抑制癌細胞增殖。益生菌生長繁殖過程中會產(chǎn)生有機酸，包括乳酸、乙酸和丁酸等，可降低腸道pH，抑制病原菌生長（袁明貴，2021；Mu，2020；翟羽佳，2018）。 綜上所述益生菌發(fā)酵紅薯渣可產(chǎn)生營養(yǎng)物質、 抗氧化物質、益生物質并延長保存時間，因此研究發(fā)酵紅薯渣作為動物飼料具有重要意義（Klempová，2020；王明瑞，2020；Shi，2017）。

本研究以粗蛋白質為指標， 添加篩選得到的4 種益生菌復合發(fā)酵， 于不同接種量和不同發(fā)酵時間進行單因素試驗。不同接種量發(fā)酵，紅薯渣中粗蛋白質含量先上升后下降； 由于添加菌液量過大，使微生物生長速率加快，營養(yǎng)消耗釋放能量，發(fā)酵溫度提高，導致酵母菌失活；與宋平等（2018）和陳洪偉等（2011）研究發(fā)酵糟渣中，接種量增大粗蛋白質含量先上升后下降結果相一致。 不同時間發(fā)酵，紅薯渣中粗蛋白質含量先升高后下降；因為益生菌生長繁殖分遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期與衰亡期，進入衰亡期發(fā)酵能力逐漸降低，所以導致粗蛋白質含量下降；與蘇玲（2021）研究油茶籽濕渣發(fā)酵隨發(fā)酵時間延長粗蛋白質含量先上升后下降結果一致。

不同發(fā)酵條件可直接影響紅薯渣中粗蛋白質含量，本研究通過正交試驗對3 種發(fā)酵條件（菌液接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度）進行優(yōu)化。 添加2種酵母菌（產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母）與2 種細菌（植物乳桿菌和糞腸球菌）復合發(fā)酵，酵母菌與細菌適宜生長溫度不同， 兩種益生菌生長溫度相差7 ℃， 篩選適宜復合菌種生長繁殖溫度至關重要（陳明，2021；林森，2008）；通過正交試驗確定最佳發(fā)酵溫度為32 ℃，可使產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌4 種益生菌生長繁殖達到最適溫度。 發(fā)酵時間會直接影響紅薯渣中粗蛋白質含量， 發(fā)酵時間過短紅薯渣中成分未完全利用，發(fā)酵時間過長生產(chǎn)成本高；本研究最佳發(fā)酵時間為3 d， 該發(fā)酵時間能高效利用紅薯渣中殘留的營養(yǎng)成分，與陳炳鈿等（2020）研究最優(yōu)發(fā)酵工藝中最佳發(fā)酵時間3 d 相一致。 相較單因素試驗最優(yōu)發(fā)酵條件5%接種量于30 ℃發(fā)酵4 d， 正交試驗中最佳條件7%接種量32 ℃恒溫發(fā)酵3 d，增加2%接種量提高2 ℃發(fā)酵溫度可縮短1 d 發(fā)酵時間，可有效降低工業(yè)生產(chǎn)成本。

歐榮娣等（2015）研究的紅薯渣固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，將紅薯渣高壓滅菌后發(fā)酵，滅菌紅薯渣發(fā)酵費時費力；本研究采用未高壓的紅薯渣發(fā)酵，不僅降低工作量，還防止高壓使紅薯渣蛋白產(chǎn)生變性，更符合生產(chǎn)實際。 綜上所述添加益生菌發(fā)酵紅薯渣可有效提高紅薯渣中粗蛋白質含量， 為發(fā)酵紅薯渣工藝奠定理論基礎。

4 結論

本研究篩選出產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌4 種益生菌，以1：1：1：1 復合發(fā)酵，確定最佳發(fā)酵條件為菌液接種量7%（V/m）、溫度32 ℃和時間3 d，表明益生菌發(fā)酵紅薯渣可提高粗蛋白質含量。