陳 蓉， 梁嘉慧， 林柳余， 梁杏燕， 王鋰韞， 饒穎竹

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，嶺南師范學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所，廣東湛江 524048）

隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的發(fā)展， 抗生素濫用加劇， 嚴(yán)重影響了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此，水產(chǎn)微生物制劑的開(kāi)發(fā)利用是推動(dòng)綠色海水養(yǎng)殖的重要措施。 乳酸菌可以有效抑制有害菌的生長(zhǎng)（董韓博等，2016）、提高攝食率和吸收率、增強(qiáng)免疫力和抗病力、增加水產(chǎn)動(dòng)物的肌肉彈性和持水性等 （夏雨等，2020； 李軍亮等，2019、2018；Ghiasi 等，2018），其具有作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑的前景。 此外，在養(yǎng)殖等水體環(huán)境中，乳酸菌具有降解氨氮和亞硝酸鹽的能力 （謝鳳行等，2019； 李詠梅等，2018）， 還能增加水體溶解氧量（黃浦江等，2019）、 有效改善水環(huán)境 （姜松等，2018），是潛在的具有應(yīng)用價(jià)值的水質(zhì)改良劑。

紅樹(shù)林在保護(hù)生物多樣性、調(diào)節(jié)氣候、凈化海水等方面具有重要的生態(tài)作用（但新球等，2016），從泰國(guó)南部紅樹(shù)林中分離出可作為食品潛在生防菌的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis）（Hwanhlem 等，2013） 和糞腸球菌（Enterococcus faecalis） （H -Kittikun 等，2015；Hwanhlem 等，2014）。廣東省湛江紅樹(shù)林是我國(guó)面積最大的紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)， 目前研究主要集中在生物資源調(diào)查保護(hù)、濕地沉積物等方面（何森華等，2021；但新球等，2016）， 關(guān)于湛江紅樹(shù)林來(lái)源的乳酸菌鮮有報(bào)道，因此，立足湛江本地海洋微生物資源，深入研究本地化紅樹(shù)林來(lái)源的海洋乳酸菌等微生物資源， 對(duì)開(kāi)發(fā)海水養(yǎng)殖微生態(tài)制劑具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究采用形態(tài)學(xué)、 生理生化試驗(yàn)、16S rDNA 及gyrB序列分析鑒定等方法對(duì)廣東省湛江市紅樹(shù)林淤泥樣品中菌株進(jìn)行分離鑒定， 并使用五種常用漁藥進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)（陳蓉等，2018）。通過(guò)單因素試驗(yàn)測(cè)定菌株最佳pH，最佳碳源、最佳氮源及其最佳濃度， 進(jìn)而采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定培養(yǎng)基最優(yōu)組合，以期篩選出一株具有耐藥性且生產(chǎn)量高的乳酸菌，為開(kāi)發(fā)本土高效的水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌和微生態(tài)制劑提供基礎(chǔ)信息。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 海洋淤泥樣品取自廣東省湛江市漁港公園紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)潮間帶， 按不同深度土層（0 ～10、10 ～15、15 ～20、20 ～25 cm）各采集一份，帶回實(shí)驗(yàn)室低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

MRS 培養(yǎng)基、HBI 乳酸菌生化鑒定條（GB），青島海博生物；DN11 細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒，北京艾德萊；藥敏試紙氨芐西林、四環(huán)素、甲氧芐胺嘧啶、利福平、復(fù)方新諾明，杭州濱和；Ex-Taq DNA 聚合酶， 日本TaKaRa；16S rDNA 序列 擴(kuò) 增 引 物 （27F：5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACYT -3'）、gyrB簡(jiǎn) 并 引 物 （UP -1：5' -GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGN ARRTTYGA-3' 和UP-2r：5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNACRTCNGCRTC NGTCAT-3'），由上海生工合成。

1.2 儀器和設(shè)備 BioPhotometer 6131 生物分光光度計(jì)， 德國(guó)Eppendorf；ZD-88 雙功能氣浴振蕩器，常州開(kāi)元；MJ Mini PCR 儀，美國(guó)BIO-RAD。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理與菌株富集 分別取5 g 不同深度土層的淤泥樣品溶于45 mL 無(wú)菌水， 振蕩搖勻。 以10%比例接種到乳酸菌MRS 肉湯培養(yǎng)基中富集，37 ℃恒溫?fù)u床（220 r/min）培養(yǎng)24 h。

1.3.2 分離篩選 取1 mL 富集后的菌液進(jìn)行稀釋， 吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋梯度的菌液各100 μL，用溶鈣圈法進(jìn)行乳酸菌篩選，用MRS 平板分離純化有溶鈣圈的單菌落，劃線數(shù)次，至單菌落形態(tài)大小相似。

1.3.3 形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定 將篩選到的菌株進(jìn)行革蘭氏染色， 在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落形態(tài)特征， 并參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》（凌代文等，1999）和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等,2001)進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.4 分子鑒定 按照本實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌分子鑒定方法進(jìn)行16S rDNA 和gyrB基因序列鑒定（陳蓉等，2018），以確定分離菌株的種屬情況。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 使用K-B 瓊脂法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在每一個(gè)MRS 平板上放置5 片同一種藥敏紙片。根據(jù)藥敏紙片抑菌圈平均直徑大小，將藥物敏感性分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）（劉開(kāi)放等，2017）。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 最佳碳氮源及其最佳濃度的篩選 將不同濃度的（10、20、30、40、50 g/L）碳源（葡萄糖、乳糖、麥芽糖）和氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母膏）分別添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按2%比例接種，37 ℃培養(yǎng)24 h， 結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)染色和血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌濃度，進(jìn)行最佳碳源、氮源及其最佳濃度篩選。

1.3.6.2 pH 對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 在最佳碳氮源及最佳濃度條件下，分別用NaOH 溶液、HCl 溶液和pH 計(jì)將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH 調(diào)至：4.0、5.0、6.0、7.0 和8.0， 按照1.3.6.1 中方法接種培養(yǎng)及計(jì)數(shù)活菌濃度，以確定培養(yǎng)基最佳pH。

1.3.7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法，以單因素試驗(yàn)確定的最佳碳源濃度、最佳氮源濃度及最佳pH 為自變量， 乳酸菌LPAR1 的活菌量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。 通過(guò)DesignExpert

8.0.6 軟件分析數(shù)據(jù)確定培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌落形態(tài)觀察 通過(guò)分離純化得到1 株乳酸菌（命名LPAR1），菌落形態(tài)呈圓形，直徑1.0 ～

2.5 mm，乳白色，表面光滑濕潤(rùn)。 在含2% CaCO3的MRS 平板上，單菌落邊緣有明顯的透明圈。 革蘭氏染色呈陽(yáng)性，球狀，成對(duì)或成四聯(lián)狀。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果 根據(jù)菌株LPAR1 的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果（表1），初步鑒定菌株LPAR1 為片球菌屬。 菌株LPAR1 在2.5 mol/L NaCl ，pH 4.0 的條件下生長(zhǎng)情況較好， 表明菌株LPAR1 有較強(qiáng)的耐酸和耐鹽能力。 這與杜志琳等（2017）從青貯飼料中分離篩選獲得的乳酸片球菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果相似。

表1 菌株LPAR1 的生理生化特征

2.3 分子鑒定結(jié)果

2.3.1 PCR 擴(kuò)增 以菌株LPAR1 總DNA 為模板，PCR 快速擴(kuò)增16S rDNA 和gyrB基因序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 結(jié)果顯示， 前者在約1500 bp 處呈單一目的條帶（圖1-a）， 后者在約1200 bp 處呈單一目的條帶（圖1-b）。

圖1 菌株LPAR1 的PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.3.2 16S rDNA 序列和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果 測(cè)序結(jié)果顯示，菌株LPAR1 的16S rDNA 序列長(zhǎng)度為1482 bp，gyrB序列長(zhǎng)度為1193 bp。 登錄NCBI，提交菌株LPAR1 的16S rDNA 和gyrB序列到GenBank 中，經(jīng)BLAST 搜索比對(duì)，結(jié)果顯示， 前者與乳酸片球菌同源性最高，為100%， 后者同樣也與乳酸片球菌同源性最高，大于99%。 采用MEGA5.0 軟件按Neighbor-Joining法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株LPAR1 均與Pediococcus acidilactici在同一分支，即菌株LPAR1 與乳酸片球菌遺傳進(jìn)化距離最近（圖2、圖3）。 根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可確定菌株LPAR1 為乳酸片球菌（P.acidilactici）。

圖2 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的菌株LPAR1 發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖3 基于gyrB 序列構(gòu)建的菌株LPAR1 發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 乳酸片球菌LPAR1 對(duì)5 種常用漁藥（復(fù)方新諾明、甲氧芐胺嘧啶、氨芐西林、利福平、四環(huán)素）的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPAR1 對(duì)利福平和氨芐西林表現(xiàn)為高度敏感（S），抑菌圈直徑分別為 （22.37±0.18）mm 和 （24.31±0.22）mm，LPAR1 對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明和甲氧芐胺嘧啶表現(xiàn)為耐藥（R），抑菌圈直徑分別為（9.70±0.43）mm、0.00 mm 和0.00 mm （表2）， 表明乳酸片球菌LPAR1 具有一定的耐藥性，其對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾的敏感性與伍元植等（2019）在湛江海域斜帶石斑魚腸道中分離的乳酸菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.5 單因素試驗(yàn)結(jié)果 當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源為乳糖、氮源為蛋白胨時(shí)，乳酸片球菌LPAR1 的菌落數(shù)達(dá)到最高（圖4-a，圖4-c）。 乳糖添加量為20 g/L 時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最高， 乳糖濃度為30 ～50 g/L菌落數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖4-b）。 當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0 g/L 時(shí)，菌落數(shù)達(dá)到最高，20 g/L 后菌落數(shù)呈現(xiàn)下降又上升的趨勢(shì) （圖4-d）。 當(dāng)pH 在4.0 ～6.0，菌落數(shù)逐漸增加，并在pH 6.0 時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最高。隨后隨著pH 升高，菌活數(shù)降低（圖4-e）。以上結(jié)果表明，在乳糖為20 g/L、蛋白胨為20 g/L、pH 為6.0 時(shí)都可以達(dá)到最佳的發(fā)酵效果。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.6.1 Box-Behnken 結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)， 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 Trail 軟件進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)（3 因素、3 水平）如表3 所示。

表3 三個(gè)因素（碳源、氮源、pH）編碼與水平值的設(shè)計(jì)

通過(guò)Design-Expert 8.0.6 Trail 軟件進(jìn)行擬合分析，得出A（pH），B（乳糖），C（蛋白胨）的多元二次回歸方程：菌落數(shù)=+6.95+1.60A+1.13B+0.47C+1.80AB -0.11AC+0.28BC-1.50A2-0.93B2-2.13C2。

回歸方程的方差分析表如表4 所示， 模型P為0.0005，小于0.001，說(shuō)明模型效果極顯著。 失擬項(xiàng)P為0.1985，大于0.05，說(shuō)明模型失擬不顯著。說(shuō)明模型能較好的反映實(shí)際情況，可以使用回歸方程預(yù)測(cè)和分析乳酸片球菌LPAR1 的生長(zhǎng)情況。

表4 回歸方程的方差分析表

各因素交互作用的響應(yīng)面圖如圖5 所示，pH和乳糖濃度交互作用較顯著（0.001＜P＜0.01），pH和蛋白胨濃度交互作用不顯著（P＞0.05），乳糖濃度和蛋白胨濃度交互作用不顯著（P＞0.05）。 A2有較顯著差異 （0.001＜P＜0.01），B2有顯著差異（0.01＜P＜0.05），C2有極顯著差異（P＜0.001）。對(duì)回歸方程進(jìn)行求導(dǎo)，得到極值點(diǎn)，即三個(gè)影響因子的最佳值：乳糖為25.00 g/L、蛋白胨為20.77 g/L、pH 為6.5， 經(jīng)響應(yīng)面模型計(jì)算得到乳酸片球菌LPAR1 菌落數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果為9.098×8log CFU/mL。

圖5 各因素交互作用對(duì)菌落數(shù)影響的響應(yīng)面曲線

2.6.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用最優(yōu)培養(yǎng)基條件 （乳糖25.00 g/L、蛋白胨20.77 g/L、pH 6.50）驗(yàn)證測(cè)試，最終測(cè)得乳酸片球菌菌落數(shù)為9.105×8log CFU/mL，這與響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)結(jié)果9.098×8log CFU/mL接近， 表明本試驗(yàn)中的模型預(yù)測(cè)結(jié)果能較好地反映實(shí)際情況。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從廣東省湛江市漁港公園紅樹(shù)林淤泥中分離篩選到一株乳酸菌LPAR1， 綜合形態(tài)學(xué)、生理生化及分子鑒定分析，確定菌株LPAR1為 乳 酸 片 球 菌 （P.acidilactici）。 乳 酸 片 球 菌LPAR1 具有耐鹽耐酸的抗逆性， 可在2.5 mol/L NaCl、pH 4.0 的條件生長(zhǎng)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸片球菌LPAR1 對(duì)氨芐西林和利福平敏感，對(duì)復(fù)方新諾明、四環(huán)素、甲氧芐胺嘧啶耐藥，表明乳酸片球菌LPAR1 具有一定的耐藥性。 單因素試驗(yàn)確定乳酸片球菌LPAR1 的最佳培養(yǎng)基條件：乳糖為碳源，蛋白胨為氮源，碳、氮源添加量為20 g/L，pH 6.0。 進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化乳酸片球菌LPAR1 的最佳培養(yǎng)基條件為：乳糖25.00 g/L、蛋白胨20.77 g/L、pH 6.5， 驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得乳酸片球菌LPAR1 菌落數(shù)為9.105×8log CFU/mL，與響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值9.08×8log CFU/mL 相近，表明本試驗(yàn)中的模型預(yù)測(cè)結(jié)果能較好地反映實(shí)際情況， 可為后續(xù)乳酸片球菌LPAR1 的量化生產(chǎn)及應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

近年來(lái)研究表明， 飼喂乳酸片球菌可增強(qiáng)魚腸道免疫反應(yīng)（Standen 等, 2013），提高對(duì)蝦的抗氧防御能力、降低對(duì)蝦的弧菌感染率（Castex 等,2010），有效改善對(duì)蝦養(yǎng)殖水質(zhì)狀況等（趙士力等,2016）。 乳酸片球菌作為微生態(tài)制劑，在改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道健康，抑制有害病菌，提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力以及凈化水體環(huán)境等方面具有一定的成效和潛力。 因此，推測(cè)親緣相近的乳酸片球菌LPAR1 在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用上具有可行性和前景性。