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        櫻桃中溴形態(tài)分析方法及其在熏蒸過程追溯中的應(yīng)用

        2022-07-07 03:05:14吳池瑩張潤何鄧曉軍盛永剛蔡文瑄陳仲兵楊曉君趙超敏
        食品科學(xué) 2022年12期

        吳池瑩,張潤何,鄧曉軍,盛永剛,蔡文瑄,謝 敏,陳仲兵,楊曉君,趙超敏,樊 祥

        (上海海關(guān),上海 200135)

        櫻桃是國內(nèi)最受歡迎的進口水果之一,在國內(nèi)占有極大的市場份額。櫻桃在種植過程中易受到實蠅、蛾類、真菌等病蟲害的影響,為防止地中海實蠅、歐洲櫻桃實蠅等檢疫性有害生物的危害,我國與土耳其、澳大利亞、阿根廷等多個國家簽訂的輸華植物檢疫要求議定書均規(guī)定,輸華櫻桃須在出口前或運輸途中經(jīng)過冷處理、熏蒸處理等預(yù)防性檢疫處理后方可入境。冷處理耗時較長,并需要先進的制冷設(shè)備,處理后易造成凍傷,櫻桃由于貨值高、時效性強,一般采用空運運輸?shù)姆绞竭M口,檢疫處理方式會選擇耗時更短的熏蒸處理。目前熏蒸普遍使用的藥劑為溴甲烷,它有廣譜、高效等特點,熏蒸后殘留氣體迅速揮發(fā),具有極高的經(jīng)濟性。由于對環(huán)境與人體的危害性,歐盟從2010年3月18日起在其成員國內(nèi)部禁止所有用途溴甲烷的使用,我國農(nóng)業(yè)部2552號公告也禁止了溴甲烷在農(nóng)業(yè)用途使用,國內(nèi)外現(xiàn)已有不少新型熏蒸劑的研究,但溴甲烷仍無法徹底被替代。溴甲烷易揮發(fā),在熏蒸過程追溯上有一定困難,溴離子是溴甲烷的代謝產(chǎn)物,國際上參考聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織給出的人體每日溴攝入量1 mg/kg制定了溴離子限量。我國GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中現(xiàn)暫無櫻桃中溴甲烷和溴離子限量要求,歐盟、日本和美國櫻桃中溴離子都設(shè)有限量為20 mg/kg,隨著溴甲烷熏蒸的使用,溴殘留的研究將會起到重要的作用。

        目前,對溴元素的研究大多集中在水質(zhì)和面粉制品上,對果蔬中溴形態(tài)的分析技術(shù)研究相對較少。食品中溴化合物的檢測方法主要有液相色譜法、離子色譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等,前處理方法主要有微波萃取法、超聲提取法、堿法消解等。近年來隨著儀器聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展,高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)法以儀器普及率高、靈敏度高、抗干擾能力強等優(yōu)點,廣泛應(yīng)用于砷、汞、鉻、硒及鹵素等元素的形態(tài)分析中。

        本研究參考各類檢測方法,通過優(yōu)化條件參數(shù),建立一種HPLC-ICP-MS法分析熏蒸后櫻桃中溴殘留的形態(tài),并使用ICP-MS測定櫻桃中總溴含量,頂空進樣-氣相色譜-電子捕獲檢測器(gas chromatography-electron capture detector,GC-ECD)法測定櫻桃中溴甲烷殘留量,用于對比和確證。本方法前處理操作簡便、分析迅速、靈敏度高,適用于櫻桃中溴形態(tài)的分析,以及溴甲烷和總溴含量的快速檢測。通過研究熏蒸前后櫻桃中溴甲烷殘留量和無機溴含量的變化情況,驗證溴甲烷熏蒸與溴殘留的關(guān)系,對櫻桃的熏蒸過程進行追溯,旨在為水果的進出口風(fēng)險監(jiān)控和質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        進口新鮮櫻桃共6 批次各3 kg。

        溴酸根標準溶液(1 000 mg/L) 美國Inorganic Ventures公司;溴離子標準溶液(1 000 mg/L)、溴甲烷標準品(2 000 mg/L) 美國O2si公司;銠標準溶液(1 000 mg/L) 國家標準物質(zhì)中心;硝酸(優(yōu)級純)、氨水(分析純)、氯化鈉(分析純) 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;25%四甲基氫氧化銨溶液上海安譜實驗科技股份有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        8800 ICP-MS儀、1260 HPLC儀、7890 GC-ECD儀安捷倫科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品制備

        獲取6 批次進口櫻桃各3 kg,選擇中等大小、較為飽滿的果實,各分為2 份,一份作為未熏蒸比對,一份按照土耳其櫻桃3 h熏蒸法再次進行熏蒸。熏蒸條件:20~22 ℃,溴甲烷投藥量145 g/m,常壓處理3 h。熏蒸完畢后,放置于0 ℃左右冷藏保存。制樣時,每次取100 g左右櫻桃,去核勻漿,現(xiàn)制現(xiàn)用。

        1.3.2 溴形態(tài)的分析

        1.3.2.1 樣品前處理

        稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中,加入25 mL去離子水,振蕩2 min,超聲提取30 min,每隔5 min振搖一次,8 000 r/min離心5 min,吸取上層清液,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,用HPLC-ICP-MS測定。

        1.3.2.2 ICP-MS儀器條件

        射頻功率1 550 W;等離子氣流速16.0 L/min;霧化氣流速1.05 L/min;霧化室溫度2 ℃;蠕動泵轉(zhuǎn)速0.3 r/s;檢測模式:氧反應(yīng)模式;檢測質(zhì)量數(shù)79。

        1.3.2.3 HPLC條件

        色譜柱:Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動相:36 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水,pH 9.0;流速1.0 mL/min;進樣量50 μL。

        1.3.2.4 測定步驟

        用去離子水配制2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L溴離子和溴酸根混合標準工作液,進行HPLC分析,以保留時間定性,色譜峰面積定量,繪制標準曲線,對樣品溶液進行分析,根據(jù)回歸方程獲得試樣中溴形態(tài)的質(zhì)量濃度。

        1.3.3 總溴含量的測定

        1.3.3.1 樣品前處理

        稱取試樣1.0 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中,加入0.5%四甲基氫氧化銨溶液25 mL,振蕩2 min,超聲提取20 min,放入烘箱中(90±5)℃恒溫消解30 min,待冷卻至室溫,經(jīng)塞脫脂棉的漏斗過濾后,用ICP-MS測定。

        1.3.3.2 ICP-MS儀器條件

        射頻功率1 600 W;等離子氣流速16.0 L/min;霧化氣流速1.0 L/min;霧化室溫度2 ℃;掃描次數(shù)30 次;重復(fù)次數(shù)3 次;積分時間1 s;蠕動泵轉(zhuǎn)速0.3 r/s;掃描方式:跳峰;檢測模式:氧反應(yīng)模式。

        1.3.3.3 測定步驟

        用0.5%四甲基氫氧化銨溶液配制0、2.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L溴標準工作溶液。用0.3 mol/L的硝酸溶液配制銠內(nèi)標溶液20.0 μg/L。選擇溴Br為待測元素,銠Rh為內(nèi)標元素,在線加入內(nèi)標,測定標準工作溶液和樣品溶液,根據(jù)回歸方程獲得試樣中總溴的質(zhì)量濃度。

        1.3.4 溴甲烷殘留量的測定

        1.3.4.1 樣品前處理

        稱取試樣10.0 g(精確至0.001 g)于20 mL頂空進樣瓶中,加入5 mL飽和氯化鈉溶液,密封,40 ℃恒溫30 min,用GC-ECD測定。

        1.3.4.2 GC條件

        色譜柱:Agilent DB-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣流速1.0 mL/min;進樣量200 μL;分流比20∶1;柱溫70 ℃;進樣口溫度100 ℃;檢測器溫度300 ℃。

        1.3.4.3 測定步驟

        根據(jù)試樣中溴甲烷含量,吸取一定量的標準儲備液,用飽和氯化鈉溶液配制成適當質(zhì)量濃度的標準工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。將標準工作溶液與試樣同時進行GC分析,計算試樣中溴甲烷的殘留量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 質(zhì)譜條件的選擇

        溴元素電離能較高,在ICP-MS上響應(yīng)較低,選擇較高的射頻功率增強儀器靈敏度。溴有79和81兩種同位素,選擇79作為檢測質(zhì)量數(shù),避免ArAr H對Br的干擾。由于水果中含有較高的鉀元素,標準模式下KAr對Br會產(chǎn)生影響,選擇氧反應(yīng)模式消除多原子離子干擾。實驗發(fā)現(xiàn),氧氣流量較高時,儀器響應(yīng)值會大幅度降低。兼顧儀器靈敏度和去干擾效果,最終控制氧氣流量在5%,并通過調(diào)諧將儀器調(diào)整到最佳狀態(tài)。

        2.2 HPLC條件的選擇

        對溴形態(tài)分析方法的HPLC條件進行優(yōu)化,提高形態(tài)分析效率。參考文獻[16]方法配制硝酸銨緩沖溶液作為流動相,配制方便,分離效果較好。酸性條件下溴離子易被氧化,形態(tài)易發(fā)生改變,影響正常離子計數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn),相同濃度的流動相pH值低于7時,溴信號強度較低,色譜峰高較低,峰寬較大;pH值高于7時,溴元素以離子形態(tài)存在,較為穩(wěn)定,溴信號較強,色譜峰形尖銳。兼顧色譜峰的分離效果和色譜柱耐受程度,最終流動相pH 9。

        圖1 18 mmol/L硝酸+34 mmol/L氨水(A)和56 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水(B)下溴形態(tài)標準溶液色譜圖Fig. 1 Chromatograms of 18 mmol/L HNO3 + 34 mmol/L NH4OH (A) and 56 mmol/L HNO3 + 67 mmol/L NH4OH (B)

        表1 不同流動相下的色譜峰出峰情況Table 1 Chromatographic peaks with different mobile phases

        從圖1可見,溴酸根出峰時間早,溴離子出峰時間晚,流動相體積分數(shù)越高,待測物出峰越快,出峰間隔時間越短,信號越強。選擇4種硝酸和氨水配比作為流動相,調(diào)節(jié)pH 9,對相同質(zhì)量濃度的溴形態(tài)標準溶液進行對比,結(jié)果見表1。18 mmol/L硝酸+34 mmol/L氨水的流動相分離效果最佳,但分析時間較長;56 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水的流動相,分析用時最少,信號最強,但兩峰的出峰間隔時間過短,分離效果不佳。兼顧分析時間和分離效果,最終選擇36 mmol/L硝酸+67 mmol/L氨水作為流動相、pH 9,8 min可以出峰完畢,在效率和效果上都滿足快速精準分析的需求。

        2.3 熏蒸后櫻桃中溴形態(tài)的分析

        采用超聲提取結(jié)合HPLC-ICP-MS法對標準溶液和6 批次溴甲烷熏蒸后櫻桃中的溴形態(tài)進行液相色譜分析,獲得色譜圖,見圖2。同時采用ICP-MS法檢測櫻桃中的總溴含量進行對比,結(jié)果見表2。

        圖2 溴形態(tài)標準溶液(A)和溴甲烷熏蒸后櫻桃中溴形態(tài)(B)色譜圖Fig. 2 Chromatograms of bromine standard solution (A) and bromine in cherries fumigated with methyl bromide (B)

        表2 溴甲烷熏蒸后櫻桃中溴酸根、溴離子與總溴的含量與色譜峰出峰時間(n=2)Table 2 Contents of bromate, bromide ion and total bromine and time of chromatographic peaks in cherries fumigated with methyl bromide (n = 2)

        實驗表明,溴酸根標準溶液出峰時間為5.656 min,溴離子標準溶液出峰時間為6.924 min,熏蒸后櫻桃中溴形態(tài)色譜圖為單峰,出峰時間如表2所示,以出峰時間定性,判斷為溴離子色譜峰,說明溴甲烷熏蒸后櫻桃中的溴元素皆為溴離子,沒有溴酸根及其他溴化物存在。水果的基質(zhì)較為簡單,經(jīng)過溴甲烷熏蒸后殘留的溴離子基本停留在水果表面,用水超聲即可提取,測得的溴離子含量與總溴含量相符,可認為熏蒸后櫻桃中的總溴殘留即為溴離子殘留。各批次之間溴離子和總溴含量的標準偏差可見,不同批次櫻桃溴殘留差異較大,這與櫻桃熏蒸位置、品質(zhì)差異等因素有關(guān)。

        據(jù)報道,臭氧也可用于果蔬的殺菌和儲存,臭氧的處理會促使溴酸根形成,但此方法一般用于消除農(nóng)藥殘留和保鮮消毒,并未在進出口果蔬的蟲害防治上使用。其他文獻調(diào)查也表明,溴酸根多殘留在水樣和米面制品中,沒有在果蔬中發(fā)現(xiàn)。溴形態(tài)分析方法在溴殘留研究中的應(yīng)用,為水果進出口的快速通關(guān)和熏蒸過程追溯提供了便利。

        2.4 方法的回收率和精密度實驗結(jié)果

        在本實驗方法下,溴酸根、溴離子以及總溴含量在2.0~100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍中皆呈良好的線性關(guān)系,獲得溴酸根回歸方程=1 651.4,=0.999 8,溴離子回歸方程=2 376.6,=0.999 8,總溴回歸方程=0.009 1+0.010 4,=0.999 9。

        表3 櫻桃中溴酸根、溴離子、總溴和溴甲烷的添加回收和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precision of bromate, bromide ion, total bromine and methyl bromide spiked in cherries (n = 6)

        將空白本底的櫻桃樣品作為基質(zhì),參考果蔬中常見限量范圍,做添加回收實驗,驗證方法的可靠性,結(jié)果見表3。在0.10、5.00、30.00 mg/kg三水平進行添加,HPLC-ICP-MS法測定溴酸根和溴離子含量,獲得溴酸根回收率為89.7%~101.4%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為2.1%~3.5%,溴離子回收率為85.5%~107.3%,RSD為4.4%~7.0%,定量限為0.10 mg/kg。在0.05、5.00、30.00 mg/kg三水平進行添加,ICP-MS法測定總溴含量,獲得回收率為92.5%~108.3%,RSD為3.1%~7.0%,定量限為0.05 mg/kg。在0.01、5.00、30.00 mg/kg三水平進行添加,GC-ECD法測定溴甲烷含量,獲得回收率為91.3%~97.0%,RSD為6.4%~8.9%,定量限為0.01 mg/kg。這3種方法回收率好、精密度高,適用于果蔬中溴殘留含量的測定,以滿足水果進出口風(fēng)險監(jiān)測要求及在熏蒸過程追溯中的應(yīng)用。

        2.5 溴甲烷熏蒸前后櫻桃中溴殘留的對比

        將同批次未熏蒸和熏蒸后的櫻桃同時進行檢測,根據(jù)櫻桃采摘熏蒸到運輸入境,以及櫻桃貨架期時長,分別在熏蒸后3、5、7、10、14、21、28 d進行測定,觀察溴甲烷殘留量和溴離子含量的變化,結(jié)果見表4和表5。

        表4 櫻桃中溴甲烷殘留量(n=2)Table 4 Contents of methyl bromide in cherries (n = 2)

        從表4可見,未熏蒸的6 批次櫻桃皆未檢出溴甲烷,熏蒸后有2 批次櫻桃檢出了少量溴甲烷。經(jīng)查詢,水果的溴甲烷熏蒸投藥量通常為32~64 g/m,土耳其櫻桃熏蒸法的投藥量高達145 g/m,如保存良好,溴甲烷熏蒸后3 d能測得少量溴甲烷,1 周后即揮發(fā)完畢無法檢出,表現(xiàn)了溴甲烷極強的揮發(fā)性。由此可見,以櫻桃在當?shù)匮艉笕刖车臅r長,無法僅憑借溴甲烷殘留量判斷熏蒸情況,為熏蒸過程追溯帶來了極大的困難。

        從表5可見,未熏蒸的6 批次櫻桃中溴離子含量較低,為0~0.177 mg/kg,熏蒸后櫻桃中溴離子含量明顯高于未熏蒸,為3.545~9.190 mg/kg,且未受時間影響呈明顯降低趨勢。此結(jié)果與國外研究報道相符,果蔬經(jīng)溴甲烷熏蒸會殘留大量溴離子,其含量會由于熏蒸位置、包裝方式、個體差異等因素有所不同,但是否經(jīng)過了有效熏蒸能直觀體現(xiàn)。溴甲烷熏蒸要求的投藥量較大,這6 批次熏蒸后的櫻桃溴離子含量皆未超過國際上溴離子限量20 mg/kg,說明145 g/m依然是較為安全的熏蒸劑量。

        表5 櫻桃中溴離子含量(n=2)Table 5 Contents of bromide ion in cherries (n = 2)

        此次獲得的6 批次進口櫻桃品質(zhì)參差不齊,個別批次發(fā)現(xiàn)害蟲,測得櫻桃中溴離子含量較低。作為對照,另外獲得了4 批次國內(nèi)確定未經(jīng)過溴甲烷熏蒸的新鮮櫻桃樣品,對其溴離子含量進行檢測,測得含量為0~0.082 mg/kg,與6 批次進口櫻桃測得結(jié)果接近。因此,可以判斷這6 批次櫻桃入境前未經(jīng)過充分的溴甲烷熏蒸。

        2.6 櫻桃樣品保存條件的對比結(jié)果

        選取3 批次熏蒸后的櫻桃,在制樣后分別進行冷藏保存和常溫保存,保存3 d和7 d后測定溴離子含量,與當天制樣進行對比,觀察櫻桃中溴離子含量是否會由于制樣時間和保存條件不同而有所變化,結(jié)果見表6。

        表6 不同保存條件下櫻桃中溴離子含量(n=2)Table 6 Contents of bromide ions in cherries under different storage conditions (n = 2)

        由表6可見,櫻桃制樣后保存條件和保存時間對溴離子含量影響較小,溴離子含量沒有因保存溫度升高而明顯降低。將櫻桃樣品在-18 ℃冰箱內(nèi)冷凍,數(shù)月后取出再次檢測,熏蒸后櫻桃中的溴離子含量仍未降低,說明了溴元素在水果內(nèi)部的穩(wěn)定性,也證明櫻桃熏蒸后的存儲條件不會使溴離子含量產(chǎn)生顯著變化。

        3 結(jié) 論

        建立了一種純水超聲快速提取、HPLC-ICP-MS檢測櫻桃中溴元素殘留形態(tài)的分析方法,并通過ICP-MS法確證其總溴含量,頂空進樣-GC法測定溴甲烷殘留量,對溴甲烷熏蒸后櫻桃中的溴殘留進行了研究。

        參照土耳其櫻桃入境檢疫要求將櫻桃進行溴甲烷熏蒸處理,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)溴甲烷熏蒸后的櫻桃中含有的溴元素皆轉(zhuǎn)化為溴離子,沒有溴酸根形成,測得的溴離子含量與總溴含量相符。通過溴甲烷熏蒸后28 d內(nèi)未熏蒸與熏蒸后櫻桃中溴甲烷殘留量和溴離子含量的對比,發(fā)現(xiàn)溴甲烷揮發(fā)性極強,在櫻桃中殘留1 周后即無法檢出,這使得海關(guān)口岸在進出口水果的蟲害控制和熏蒸過程追溯上有一定難度,無法通過溴甲烷殘留量判定水果入境前的熏蒸情況。而熏蒸前后櫻桃中的溴離子含量有明顯的差異,熏蒸后櫻桃中的溴離子殘留量遠高于未熏蒸,并且在櫻桃內(nèi)部穩(wěn)定存在。對櫻桃中溴離子殘留量的監(jiān)控,是甄別櫻桃入境前是否進行了溴甲烷熏蒸的有效手段,也是衡量熏蒸后的溴殘留是否在安全范圍的可靠方式。

        本方法快速、簡便、精密度高,在水果熏蒸過程追溯的應(yīng)用上可取代溴甲烷殘留量的分析,在水果進出口風(fēng)險監(jiān)控篩查中發(fā)揮作用,促進口岸監(jiān)管方式的轉(zhuǎn)型升級。

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