劉 雪，任晨瑜,2，劉 新，張綿松，白新峰，王令書，崔婷婷，史亞萍，劉昌衡，賈愛榮,*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟南 250103；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟南 250353；3.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053）

多糖是近年來研究較多的一種活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖降血脂等生物活性。但是，多糖作用靶點不明確、分子質(zhì)量大、黏度高、生物利用度低，極大限制了其在醫(yī)藥上的開發(fā)應(yīng)用。近年來，寡糖的相關(guān)研究逐漸增多，與多糖相比，寡糖結(jié)構(gòu)清晰、水溶性高、生物利用度好，部分寡糖顯示出與母糖相似或高于母糖的生物活性。因此，寡糖的開發(fā)研究對糖類化合物的發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

褐藻糖膠又名巖藻聚糖硫酸酯，是一種硫酸化多糖，廣泛存在于褐藻和海洋無脊椎動物中。褐藻糖膠具有明顯的抗凝血活性，Mansour等從海參中分離出高分子質(zhì)量，高硫酸基含量的褐藻糖膠，這種褐藻糖膠表現(xiàn)出主要由肝素輔因子II介導(dǎo)的強抗凝血活性。Wang Jing等從海帶中得到了3種低分子質(zhì)量褐藻糖膠，這3種多糖均能顯著延長活化部分凝血酶時間、凝血酶時間和凝血酶原時間，具有較好的抗凝血活性。Li Bo等研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜巖藻聚糖硫酸酯能夠顯著延長活化部分凝血酶時間，具有良好的抗凝血活性。羊棲菜（）是一種常見的褐藻，隸屬于褐藻門墨角藻目馬尾藻科，具有較高的食用和藥用價值，廣泛分布于我國的淺海水域，韓國、日本也有分布。褐藻糖膠是羊棲菜中重要的活性成分，但是，羊棲菜褐藻糖膠也存在分子質(zhì)量大、黏度高等特點，限制了它的開發(fā)利用。寡糖的研究有利于推進褐藻糖膠進一步的發(fā)展。

本實驗從羊棲菜中分離純化得到一種褐藻糖膠，采用酸降解法降解得到5種寡糖組分，通過測定活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）評價其抗凝血活性。篩選高抗凝血低分子質(zhì)量寡糖組分，對其結(jié)構(gòu)進行質(zhì)譜解析，探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜取自于2018年5月采自浙江省平陽縣南麂島國家海洋自然保護區(qū)。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Flu-ka公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白和低分子質(zhì)量肝素鈉 美國Sigma公司；乙腈（色譜純） 美國Tedia公司；APTT、TT、PT測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；DEAE-Sepharose Fast Flow 美國GE healthcare公司；Bio-gel P4（Fine，45 μm） 美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Elipse XDB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm）、1260高效液相色譜儀、LCMS6460質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；ohpak SB-804HQ高效凝膠滲透色譜柱日本Shodex公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；SL-318半自動血凝儀 濟南森藍公司。

1.3 方法

1.3.1 褐藻糖膠提取和分離純化

羊棲菜褐藻糖膠的提取參照Silchenko等的方法且略作修改。將羊棲菜洗凈烘干，粉碎成末。取適量藻體粉末，加入95%乙醇脫脂，料液比為1∶30（g/mL），室溫下攪拌24 h。取適量脫脂后的藻體粉末，加入2% CaCl溶液，料液比為1∶30（g/mL），60 ℃攪拌3 h，靜置，冷卻到室溫，離心，收集上層清液。將上層清液超濾濃縮，截留分子質(zhì)量為100 kDa。濃縮后的提取液加入4 倍體積95%乙醇溶液，醇沉，4 ℃靜置過夜12 h，離心，收集沉淀部分。沉淀經(jīng)無水乙醇脫水后，置于40 ℃烘箱中干燥，得到羊棲菜多糖粗品。采用DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱（4.0 cm×30 cm）對羊棲菜多糖進行分離純化，0、0.5、1、2、3 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，收集2 mol/L洗脫組分，除鹽、濃縮凍干，命名為SFF。

1.3.2 HPGPC法測定分子質(zhì)量

將不同分子質(zhì)量系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和待測SFF配制成5 mg/mL的溶液，在下述條件下測定分子質(zhì)量。分析柱：Shodex ohpak SB-804HQ（7.6 mm×300 mm），示差折光檢測器在線檢測，流動相0.1 mol/L NaSO溶液，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL。繪制以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子質(zhì)量對數(shù)為縱坐標(biāo)，保留時間為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算樣品的分子質(zhì)量。

1.3.3 單糖組成

采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定SFF的單糖組成。準(zhǔn)確稱取2 mg樣品，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，110 ℃條件下降解6 h，得到完全酸水解的單糖樣品。對單糖標(biāo)準(zhǔn)品及完全酸水解的單糖樣品進行PMP衍生，首先將其溶于100 μL蒸餾水，加入100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液及120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，置于70 ℃水浴中反應(yīng)100 min。反應(yīng)完畢后中和，用二氯甲烷萃取3 次，除去未反應(yīng)的PMP，上層液體過0.22 μm的微孔濾膜后進行高效液相色譜分析。色譜條件：C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動相為磷酸緩沖溶液-乙腈（83∶17，/），流速1.0 mL/min，紫外檢測器檢測。

1.3.4 理化性質(zhì)

總糖含量：采用硫酸-苯酚法測定，蛋白含量：采用Folin-酚法測定；硫酸基含量：采用氯化鋇明膠比濁法測定；糖醛酸含量：采用咔唑-硫酸法測定。

1.3.5 寡糖的制備

將多糖以0.1 mol/L HCl溶液配制成10 mg/mL，于80 ℃水浴10 h，反應(yīng)液降至室溫后，調(diào)節(jié)pH值至中性。透析（截留分子質(zhì)量為100 Da），濃縮凍干，樣品備用。

1.3.6 寡糖的分離純化

降解產(chǎn)物采用Bio-Gel P4色譜柱進行分離純化。以0.2 mol/L NHHCO溶液為流動相，0.1 mL/min洗脫，洗脫后采用硫酸-苯酚法檢測，收集峰尖部分，除氨凍干。

1.3.7 寡糖的質(zhì)譜分析

采用負離子模式下的電噴霧質(zhì)譜對寡糖進行分析。取少量寡糖組分，以乙腈-水（1∶1，/）溶液溶解，使其濃度達到5～10 pmol/L，注射5 μL進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析中，以氮氣作為溶劑的吹干氣體和噴霧氣體，流速分別為250 L/h和15 L/h；流動相為乙腈-水（1∶1，/），在泵的動力下，從注射器以10 μL/min的流速注入；毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為50 eV，離子源和溶劑揮發(fā)溫度分別為80 ℃和150 ℃。

1.3.8 核磁共振波譜分析

稱取10 mg寡糖樣品，用重水溶解后凍干，反復(fù)3 次。得到的樣品溶于0.5 mL重水中，加入少量內(nèi)標(biāo)氘代丙酮，采用Bruker Avance III HD 400 MHz核磁共振波譜儀測定核磁圖譜。

1.3.9 抗凝血活性測定

將SFF配制成0.5、1.0、2.5 mg/mL，與血漿以1∶9的體積比混合。APTT、TT、PT的測定按照試劑盒要求進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻糖膠的分離純化、分子質(zhì)量和理化性質(zhì)分析

從羊棲菜中提取得到褐藻糖膠粗品，經(jīng)DEAESepharose Fast Flow陰離子交換柱分離純化，得到3個明顯的洗脫峰（圖1），收集含量最高的2 mol/L NaCl溶液洗脫組分為SFF。測定褐藻糖膠SFF的分子質(zhì)量和理化性質(zhì)如表1所示。SFF的分子質(zhì)量較高，為708 kDa；總糖質(zhì)量分數(shù)為56.44%；蛋白質(zhì)量分數(shù)較低，為1.14%；硫酸基質(zhì)量分數(shù)為26.22%，不含糖醛酸。SFF的分子質(zhì)量和理化性質(zhì)測定結(jié)果與前期報道的結(jié)果相似。

圖1 褐藻糖膠SFF的分離純化圖Fig. 1 Chromatogram for separation and purification of SFF

表1 褐藻糖膠SFF的理化性質(zhì)分析Table 1 Physicochemical properties of SFF

2.2 褐藻糖膠的單糖組成分析

如圖2所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對比可知，SFF由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖4種糖基組成，物質(zhì)的量比為67.11∶26.69∶2.54∶3.66，其中巖藻糖和半乳糖為主要組成成分。SFF含有大量的硫酸基團和巖藻糖，進一步表明SFF是褐藻糖膠的一種。

圖2 褐藻糖膠SFF的單糖組成分析Fig. 2 Monosaccharide composition of SFF

2.3 寡糖的分離純化

將多糖降解產(chǎn)物配制成10 mg/mL，經(jīng)Bio-Gel P4色譜柱分離純化，洗脫液以硫酸-苯酚法檢測糖含量，繪制洗脫曲線，如圖3所示。多糖降解產(chǎn)物分離后，得到5種寡糖組分，根據(jù)分子質(zhì)量大小，命名為P1～P5，其中P1分子質(zhì)量最大。

圖3 褐藻糖膠SFF降解產(chǎn)物的Bio-Gel P4譜圖Fig. 3 Gel permeation chromatogram of oligosaccharides on Bio-Gel P4

2.4 寡糖的抗凝血活性

在凝血機制中，APTT反映了內(nèi)源性或者共同凝血途徑，TT反映了對凝血酶活性或者纖維蛋白的作用，PT反映了外源性凝血途徑。本實驗測定5種寡糖組分對APTT、TT、PT的延長作用，以評價寡糖的抗凝血活性。如表2所示，5種寡糖組分均可延長APTT，其中寡糖組分P1、P2、P3對APTT的延長作用高于P4、P5，P3的延長作用尤其明顯。對TT和PT無延長作用，說明羊棲菜褐藻糖膠寡糖組分對內(nèi)源性或者共同凝血途徑有抑制作用，對凝血酶活性、纖維蛋白的聚合以及外源性凝血途徑的作用不大。與肝素相比，寡糖組分對APTT的延長作用偏低，但是較為溫和，隨著濃度的增加，延長作用逐漸增加，而肝素在50 μg/mL時，APTT已達到200 s。此外，肝素對PT和TT均具有顯著的延長作用，而寡糖組分對PT和TT的延長作用不明顯，說明羊棲菜褐藻膠寡糖與肝素的抗凝機制不完全相同。目前，有關(guān)褐藻糖膠/褐藻糖膠寡糖的抗凝血活性研究較少，抗凝血寡糖的結(jié)構(gòu)研究更為少見。趙雪等采用自由基氧化降解法制備了不同分子質(zhì)量和硫酸基含量的褐藻糖膠，測定了抗凝血活性，揭示了褐藻糖膠中影響抗凝血活性的主要因素，但是，對高抗凝血活性褐藻糖膠的結(jié)構(gòu)并無說明，且分子質(zhì)量降低后活性明顯降低。Wang Jing等從海帶中分離得到的3種低分子質(zhì)量褐藻糖膠，均能顯著延長活化部分凝血酶時間、凝血酶時間和凝血酶原時間，具有較好的抗凝血活性，但是分子質(zhì)量仍較大，為4～8 kDa。

表2 褐藻糖膠SFF寡糖組分的抗凝血活性Table 2 Anticoagulant activity of oligosaccharides derived from SFF

2.5 寡糖組分P3的質(zhì)譜及核磁共振波譜分析

寡糖組分P3是具有高抗凝血活性同時分子質(zhì)量最小的組分，因此，采用質(zhì)譜法對P3的結(jié)構(gòu)進行解析，探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。負離子模式下的一級質(zhì)譜（圖4）顯示P3主要存在雙電荷離子峰/307，表明P3主要由分子質(zhì)量為616 Da的寡糖片段組成，推斷其為二硫酸化巖藻三糖[Fuc(SO)]。二級質(zhì)譜給出了/307（圖5）的斷裂片段，但是信息相對較少。因此，對寡糖組分P5、P4中的寡糖片段進行質(zhì)譜分析，進而推斷出二硫酸化巖藻三糖的結(jié)構(gòu)。

圖4 寡糖組分P3的負離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 4Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P3

圖5 寡糖片段m/z 307二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 307

圖6 是寡糖組分P5的一級質(zhì)譜，離子/243推斷為硫酸化巖藻單糖，是其主要的寡糖片段。二級質(zhì)譜（圖7）顯示了離子/243斷裂片段信息，碎片離子/139推斷為X斷裂，而X斷裂是C-2硫酸化的主要斷裂方式，推斷硫酸基團可能位于C-2位。高豐度碎片離子/97的出現(xiàn)表明硫酸基團也可能位于C-3位。因此，硫酸基團可能位于巖藻糖的C-2或C-3位。

圖6 寡糖組分P5的負離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 6 Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P5

圖7 寡糖片段m/z 243二級質(zhì)譜圖Fig. 7 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 243

圖8 是寡糖組分P4的一級質(zhì)譜，離子/389推斷為硫酸化巖藻二糖，是其主要的寡糖片段之一。二級質(zhì)譜（圖9）顯示了離子/389的碎片離子信息，/329的出現(xiàn)表明二糖間的連接方式為1→4連接，且還原端巖藻糖C-3位上無硫酸基團。未出現(xiàn)碎片離子/139表明還原端巖藻糖的C-2位上無硫酸基團，因此硫酸基團位于非還原端的C-2或C-3位。綜上所述，硫酸化巖藻二糖可能存在以下異構(gòu)體：--Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc和-Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc。

圖8 寡糖組分P4的負離子電噴霧質(zhì)譜圖Fig. 8 Negative-ion ES-MS spectrum of oligosaccharide fraction P4

圖9 寡糖片段m/z 389二級質(zhì)譜圖Fig. 9 Negative-ion ES-CID-MS/MS product-ion spectrum of fragment at m/z 389

根據(jù)上述分析結(jié)果可知，SFF寡糖組分的硫酸基團位于巖藻糖基的C-2和C-3位，巖藻糖基之間的連接方式為1,4-連接。推斷離子/307為二硫酸化巖藻三糖，因此，它的結(jié)構(gòu)可能是在硫酸化巖藻二糖的基礎(chǔ)上增加硫酸基團及巖藻糖殘基。在離子/307的二級質(zhì)譜中，碎片離子/139的出現(xiàn)表明存在還原端C-2位硫酸基團，相對高豐度碎片離子/97的出現(xiàn)表明硫酸基團也可能位于巖藻糖殘基的C-3位，這與前述分析結(jié)果一致。此外，碎片離子/234推斷為二硫酸化巖藻二糖，表明兩個硫酸基團相鄰。因此，離子/307可能存在以下異構(gòu)體，如圖10所示，--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)---Fuc(3SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)---Fuc(3SO)。二硫酸化巖藻三糖中硫酸基團的位置還可通過核磁共振氫譜進一步確定。如圖11所示，低場區(qū)5.00～5.50為--Fuc異頭氫所在的區(qū)域，主要有3個異頭氫信號5.16、5.26及5.42，1.25是巖藻糖C-6位甲基上的氫信號。根據(jù)文獻報道，5.42處為2-硫酸化-巖藻糖殘基，5.26處為3-硫酸化-巖藻糖殘基。其中，5.26處的異頭氫信號強度最高，說明二硫酸化巖藻三糖的硫酸基團主要位于C-3位。這與質(zhì)譜分析結(jié)果一致，進一步說明了二硫酸化巖藻三糖的硫酸基團位于C-2和C-3位，C-3位是主要的硫酸化位點。

硫酸化多糖的生物活性與多種因素有關(guān)，如分子質(zhì)量、硫酸基團含量等。Liu Xue等從綠藻中提取得到硫酸化鼠李聚糖，發(fā)現(xiàn)其抗凝血活性隨著分子質(zhì)量的減小逐漸降低。Mazumder等從紅藻中提取得到硫酸化半乳聚糖，其抗病毒活性與分子質(zhì)量密切相關(guān)，分子質(zhì)量越高，對單純皰疹病毒I和II的選擇性抗病毒活性越明顯。硫酸基團含量也是影響多糖生物活性的重要因素，Koyanagi等研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠和過硫酸化褐藻糖膠均可抑制血管內(nèi)皮生長因子的有絲分裂和趨化性，但是過硫酸化褐藻糖膠的抑制作用更加明顯。本實驗中，寡糖組分P3主要是二硫酸化巖藻三糖，P4主要是硫酸化單糖（/243）和硫酸化/二硫酸化二糖（/389、405、485）的混合物，P5主要是硫酸化單糖。與P4和P5相比，寡糖組分P3具有更高的分子質(zhì)量，同時也具有一定的硫酸基團含量，這可能是導(dǎo)致P3抗凝血活性高于P4和P5主要原因。

圖10 寡糖組分P3的結(jié)構(gòu)片段Fig. 10 Proposed sequence of oligosaccharide fraction P3

圖11 寡糖組分P3的核磁共振氫譜Fig. 11 1H NMR spectrum of oligosaccharide fraction P3

3 結(jié) 論

從羊棲菜中提取并分離純化得到褐藻糖膠SFF。通過高效液相色譜法、高效凝膠滲透色譜法、化學(xué)法測定了褐藻糖膠的單糖組成、分子質(zhì)量、理化性質(zhì)。采用鹽酸降解法將SFF降解成寡糖，并通過Bio-gel P4凝膠色譜柱有效分離，最終得到5種寡糖組分P1～P5。5種寡糖組分均可延長APTT，其中寡糖組分P1、P2、P3對APTT的延長作用高于P4、P5，P3的延長作用尤為明顯。5種寡糖組分對TT和PT無延長作用，說明SFF寡糖主要對內(nèi)源性和共同凝血途徑有抑制作用。選擇高抗凝血活性同時分子質(zhì)量最小的寡糖組分P3進行質(zhì)譜分析，探究羊棲菜抗凝血褐藻糖膠寡糖的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，寡糖組分P3純度較高，主要由二硫酸化巖藻三糖寡糖片段組成，結(jié)構(gòu)為--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)--Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)--Fuc(2SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(3SO)-(1→4)--Fuc(3SO)，--Fuc-(1→4)---Fuc(2SO)-(1→4)--Fuc(3SO)。本實驗篩選出一種具有良好抗凝血活性的高純度寡糖組分，揭示其結(jié)構(gòu)特點，豐富了抗凝血褐藻糖膠寡糖的研究。