黃 國(guó)，田澤鵬，薛麗瑩，陳 騏，王 迪，衣艷嬌，李 萌，孫書境，隋曉楠,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是我國(guó)優(yōu)質(zhì)植物蛋白的重要來(lái)源，由于其良好的功能特性和豐富的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于各種食品加工領(lǐng)域中。-伴大豆球蛋白（-conglycinin，7S）和大豆球蛋白（glycinin，11S）是大豆蛋白中的主要儲(chǔ)藏蛋白，其含量占大豆蛋白總量的70%。7S蛋白（150～180 kDa）是由3個(gè)不同的（67 kDa），’（71 kDa）和（50 kDa）亞基組成的三聚體，這些亞基主要通過(guò)疏水相互作用和氫鍵連接；11S蛋白（約360 kDa）是由兩個(gè)三聚體堆疊而成的六聚體，每個(gè)三聚體包含3個(gè)亞基，每個(gè)亞基由酸性多肽A（35 kDa）和堿性多肽B（20 kDa）通過(guò)二硫鍵連接。近年來(lái)，由于食品級(jí)蛋白質(zhì)對(duì)生物活性物質(zhì)具有潛在的傳遞和包埋作用，大豆蛋白作為其生物活性物質(zhì)的載體而備受關(guān)注。一方面，大豆蛋白中含有豐富的疏水性/親水性，帶電氨基酸，這使大豆蛋白具有通過(guò)靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用等與小分子相互作用的潛力。這些相互作用使多酚等小分子活性物質(zhì)包埋在大豆蛋白的三維網(wǎng)絡(luò)中，例如VB、姜黃素、花青素、原花青素等，能夠保留其生理活性并將其釋放到體內(nèi)的目標(biāo)部位。另一方面，與生物活性化合物的絡(luò)合可以改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。例如：大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）與單寧的相互作用導(dǎo)致SPI發(fā)生交聯(lián)，從而影響了蛋白質(zhì)的凝膠特性?；ㄇ嗨嘏cSPI的結(jié)合誘導(dǎo)了SPI二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而改善了SPI的穩(wěn)定性和消化特性。兒茶素可以增強(qiáng)7S蛋白的抗氧化性并促進(jìn)了7S蛋白消化率的提高。盡管已經(jīng)有大量的研究關(guān)注大豆蛋白與多酚等小分子的相互作用，然而這主要集中于大豆蛋白的混合物，如SPI，或單一的大豆蛋白組分，如7S/11S蛋白。正如前所述，7S和11S蛋白的分子質(zhì)量和構(gòu)象差異可能導(dǎo)致大豆蛋白與多酚等小分子的相互作用發(fā)生變化。因此，了解不同大豆蛋白組分和多酚等小分子之間的相互作用方式及其結(jié)合機(jī)理是有必要的。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（(–)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶中最主要的兒茶素，約占綠茶中兒茶素的40%。EGCG具有3個(gè)芳香環(huán)，1個(gè)吡喃環(huán)和8個(gè)酚羥基。與其他多酚相比，芳香環(huán)上大量活性酚羥基賦予EGCG優(yōu)異的理化和功能特性，如抗氧化、抗腫瘤和抗病毒作用等，因此也被廣泛用作食品添加劑。另一方面，EGCG分子可以通過(guò)酚羥基與環(huán)形結(jié)構(gòu)形成氫鍵和疏水相互作用與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。當(dāng)將EGCG添加到大豆蛋白的食品中時(shí)，EGCG與大豆蛋白之間的互作可能賦予大豆蛋白更好的功能特性和一些額外的健康益處。You Yaohui等通過(guò)熒光光譜法發(fā)現(xiàn)SPI和EGCG之間相互作用力主要是依靠疏水相互作用和氫鍵，并表示EGCG使SPI結(jié)構(gòu)變得松散，SPI的起泡性、乳化性和抗氧化性得到改善。EGCG的加入導(dǎo)致SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋與-折疊發(fā)生一定的轉(zhuǎn)變，并增強(qiáng)了SPI的熱穩(wěn)定性。此外，EGCG還可以通過(guò)疏水相互作用和氫鍵與大豆蛋白形成不溶性聚集體，提高了大豆蛋白水解液中蛋白質(zhì)的回收率。盡管EGCG的添加可能會(huì)影響大豆蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性，但大多數(shù)研究?jī)H限于大豆蛋白混合物或單一的蛋白組分。對(duì)于7S蛋白、11S蛋白與EGCG之間的作用機(jī)理的差異需要進(jìn)一步研究。

因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究中性條件下7S/11S蛋白與EGCG之間的相互作用方式及結(jié)合機(jī)理，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜及熒光光譜表征大豆蛋白與EGCG結(jié)合特性，并分析其相互作用類型與熱力學(xué)特征；還通過(guò)傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜提供相關(guān)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化信息；最后利用分子對(duì)接了解7S/11S蛋白與EGCG之間的相互作用的類型和參與相互作用的氨基酸殘基。以期在分子水平上提供不同蛋白質(zhì)組分和多酚的相互作用機(jī)制的見(jiàn)解，同時(shí)也為大豆蛋白功能性食品的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（綏農(nóng)53號(hào)） 國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心；EGCG（純度≥98.0%） 西安通澤生物科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（sodium 8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS-Na，純度＞97.0%） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；實(shí)驗(yàn)室中所用試劑均為分析純；所用實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、RF-6000熒光分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；F-7100熒光分光光度計(jì)日本Hitachi公司；Nicolet iS50 FTIR光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī)美國(guó)SIM公司；KQ100超聲波清洗機(jī) 昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 7S/11S蛋白的制備

參考Nagano等的方法并稍作修改。大豆粉碎，過(guò)60 目篩，將大豆粉按照料液比1∶3（g/mL）分散于正己烷中，并在室溫下攪拌2 h后，富集上清液正己烷進(jìn)行冷凝回收，重復(fù)脫脂5 次。將沉淀物進(jìn)行干燥，得到的大豆脫脂豆粉。將其按料液比1∶10（g/mL）分散于去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.5，室溫?cái)嚢? h后，在4 ℃、10 000×離心30 min，除去沉淀物，向上清液中加入0.98 g/L干燥的亞硫酸氫鈉。用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 6.4后在4 ℃條件下保持過(guò)夜，在4 ℃、6 500×離心20 min，得到11S沉淀物。為了制備7S蛋白，在上述步驟得到的上清液加入0.25 mol/L的固體NaCl，并用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 5.0，攪拌1 h。而后在4 ℃、10 000×離心30 min，除去沉淀物。將得到的上清液用相同體積的冰冷水稀釋，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.8，室溫靜置1 h后，在4 ℃、6 500×離心20 min，得到7S沉淀物。

將7S/11S沉淀物進(jìn)行5 次水洗后，并分散于10 倍的去離子水中重新溶解并調(diào)節(jié)pH 7.5。分別將懸浮液透析48 h（3 500 Da），每6 h換一次水，而后進(jìn)行冷凍干燥研磨貯存。經(jīng)杜馬斯法（N×6.25）分析測(cè)定，分別得到蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（90.30±0.15）%、（96.7±0.10）%的7S/11S蛋白。

1.3.2 7S/11S蛋白-EGCG復(fù)合體系的構(gòu)建

將7S/11S蛋白分散于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），室溫?cái)嚢? h后，4 ℃冰箱過(guò)夜充分水化，最終蛋白母液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。將EGCG分散于0.01 mol/L pH 7.0 PBS中，避光室溫?cái)嚢? h后定容，得到64 μmol/L EGCG母液。超聲10 min進(jìn)行脫氣處理，4 ℃冰箱備用。將蛋白溶液與EGCG溶液按照不同梯度進(jìn)行稀釋混合至所需濃度，在設(shè)置溫度下反應(yīng)2 h后，冰水浴30 min終止反應(yīng)，以獲得大豆蛋白-EGCG復(fù)合體系。

1.3.3 紫外-可見(jiàn)光吸收光譜分析

參考劉英杰等的方法并稍作修改。將7S/11S蛋白與EGCG溶液進(jìn)行混合，最終蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，EGCG濃度分別為0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L。在298 K水浴恒溫反應(yīng)2 h，冰水浴30 min后，取出恢復(fù)室溫后進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光吸收光譜分析。波長(zhǎng)范圍設(shè)置為250～350 nm，速率為中速，狹縫寬為2 nm。其中以未添加EGCG即EGCG濃度為0 μmol/L的蛋白樣品為空白對(duì)照，下同。

1.3.4 內(nèi)源性熒光光譜分析

將1.3.3節(jié)配制好的7S/11S蛋白與EGCG混合溶液，在298、304、310 K水浴恒溫反應(yīng)2 h，冰水浴30 min后，取出恢復(fù)室溫后進(jìn)行內(nèi)源性熒光光譜測(cè)量。使用RF-6000熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～460 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬帶均為5 nm，掃描速率為2 000 nm/min。

1.3.5 外源性熒光光譜分析

使用ANS疏水熒光探針?lè)y(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性。將1.3.3節(jié)所配制好的7S/11S蛋白與EGCG混合溶液，在298 K水浴恒溫反應(yīng)2 h，冰水浴30 min后，取出恢復(fù)室溫后進(jìn)行外源性熒光光譜測(cè)定。將50 μL的8 mmol/L ANS溶液添加到5.0 mL的7S/11S蛋白與EGCG混合溶液中，旋渦振蕩30 s，避光反應(yīng)15 min后測(cè)量其熒光強(qiáng)度。使用F-7100熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400～600 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬帶均為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min，電壓為500 V。

1.3.6 FTIR光譜分析

將EGCG粉末按EGCG∶大豆蛋白為0∶1、1∶2（/）比例添加至1 g/100 mL的7S/11S蛋白溶液中，避光攪拌2 h，以確保充分反應(yīng)。將混合物置于透析袋（3 500 Da）中以除去游離的EGCG，并在4 ℃條件下透析48 h。每6 h更換一次去離子水，最后將透析袋中的懸浮液冷凍干燥以獲得大豆蛋白-EGCG復(fù)合物。將蛋白質(zhì)樣品與KBr粉末以1∶100（/）充分混合研磨后壓片，進(jìn)行FTIR光譜分析。測(cè)定波數(shù)范圍為4 000～500 cm，并以1 cm的分辨率掃描32 次。利用Peak Fit 4.12軟件對(duì)所獲得的掃描圖譜中的1 700～1 600 cm酰胺I帶進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量分析。

1.3.7 分子對(duì)接

使用Pymol 16.0軟件對(duì)大豆蛋白晶體模型（7S，PDB ID：1UIK；11S，PDB ID：1OD5）進(jìn)行預(yù)處理。而后使用Autodocking Tool 4.12軟件對(duì)EGCG與預(yù)處理的大豆蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，獲得EGCG與大豆蛋白的結(jié)合構(gòu)象和對(duì)接作用最小能量模式圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定重復(fù)3 次，利用SPSS Statistics 23軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析，＜0.05，差異顯著。采用Origin 9.1、Peak Fit 4.12等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表制作以及FTIR光譜蛋白吸收峰進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)大豆7S/11S蛋白紫外-可見(jiàn)光吸收光譜的影響

紫外-可見(jiàn)光吸收光譜是研究小分子和蛋白質(zhì)之間互作的常見(jiàn)方法。在250～350 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)中Trp和Tyr殘基的共軛雙鍵在280 nm波長(zhǎng)處附近具有吸收峰。蛋白質(zhì)分子中的氨基酸殘基的微環(huán)境變化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移或藍(lán)移，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。如圖1所示，隨著EGCG添加量增大，7S/11S蛋白吸收譜強(qiáng)度均有增加，這可能是由于EGCG與Trp和Tyr殘基之間形成了新的共軛體系，π-π電子對(duì)能級(jí)躍遷，吸光度增加。同時(shí)，7S/11S蛋白的最大吸收值峰位發(fā)生了輕微的藍(lán)移，這表明EGCG與大豆蛋白的相互作用改變了Trp和Tyr殘基的微環(huán)境，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，這與Wang Chen等的研究結(jié)果一致。

圖1 不同EGCG濃度下7S（A）、11S（B）紫外-可見(jiàn)光吸收光譜曲線Fig. 1 UV-Vis absorption spectra of 7S (A) and 11S (B) in the presence of different EGCG concentrations

2.2 內(nèi)源性熒光光譜分析

2.2.1 EGCG對(duì)7S/11S蛋白內(nèi)源性熒光光譜的影響

熒光光譜法是研究受體與配體相互作用的常見(jiàn)方法，因其方便、快捷、靈敏度高被而廣泛使用，從而確定受體與配體分子的結(jié)合方式與結(jié)合類型。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，蛋白質(zhì)的固有熒光主要是來(lái)自于Trp與Tyr殘基，而Phe殘基由于量子產(chǎn)率低而常忽略不計(jì)。如圖2所示，與7S蛋白相比，11S蛋白顯示出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，這是由于其蛋白含有較高含量的Trp與Tyr，與這與Li Jufang等的報(bào)道一致。當(dāng)添加EGCG時(shí)，7S/11S蛋白的熒光強(qiáng)度下降，這表明EGCG對(duì)7S/11S蛋白具有猝滅作用，且猝滅效果與EGCG添加量有較強(qiáng)的依賴性。EGCG的添加使得7S/11S蛋白最大熒光峰的波長(zhǎng)發(fā)生了輕微的紅移，這表明EGCG與7S/11S蛋白之間發(fā)生了相互作用，蛋白質(zhì)主肽鏈變得舒展，埋藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部中的Trp與Tyr殘基暴露至更親水性的環(huán)境。除此之外，當(dāng)EGCG添加量最大時(shí)，EGCG對(duì)7S/11S的猝滅效率分別為（58.75±1.34）%、（67.07±2.05）%，這說(shuō)明EGCG與11S蛋白相互作用更強(qiáng)。

圖2 不同EGCG濃度下7S（A）、11S（B）熒光光譜曲線Fig. 2 Fluorescence spectra of 7S (A) and 11S (B) in the presence of different EGCG concentrations

2.2.2 熒光猝滅類型分析

為了解EGCG與7S/11S蛋白之間相互作用的熒光猝滅機(jī)理，通過(guò)Stern-Volmer方程（1）進(jìn)行相關(guān)猝滅常數(shù)的計(jì)算。猝滅常數(shù)是判定分子之間動(dòng)態(tài)與靜態(tài)猝滅的關(guān)鍵數(shù)據(jù)。具體而言，在靜態(tài)猝滅中，猝滅常數(shù)隨溫度的升高而降低；而對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，其變化趨勢(shì)與靜態(tài)猝滅相反。

式中：、分別為不添加EGCG與添加EGCG后大豆7S/11S蛋白的熒光強(qiáng)度；[]為EGCG濃度/（mol/L）；為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；為分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；為不添加猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命10s。

圖3 不同溫度下7S（A）、11S（B）與EGCG相互作用的Stern-Volmer圖Fig. 3 Stern-Volmer curves for the interaction of different temperatures of EGCG with 7S (A) and 11S (B)

如圖3和表1所示，7S蛋白和11S蛋白的和值隨溫度升高而增加。這些結(jié)果表明EGCG與大豆蛋白兩者之間由于分子間碰撞而引起了動(dòng)態(tài)猝滅。此外，7S/11S蛋白的值遠(yuǎn)高于最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（2.0×10L/（mol?s）），該結(jié)果表明以形成基態(tài)穩(wěn)定復(fù)合物的靜態(tài)猝滅方式在大豆蛋白與EGCG結(jié)合中起著重要作用。因此，綜上表明7S/11S蛋白與EGCG的相互作用方式是動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅同步發(fā)生，這與Zhang Jing等研究結(jié)論一致。同樣，王晨等研究了小麥谷蛋白與矢車菊素-3--葡萄糖苷的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3--葡萄糖苷以動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅相結(jié)合的方式使得小麥谷蛋白發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。

表1 不同溫度下7S、11S的熒光猝滅常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants (KSV) and molecular quenching constants (Kq) for 7S and 11S at different temperatures

2.2.3 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算

對(duì)于靜態(tài)猝滅，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：、分別為不添加EGCG與添加EGCG后大豆7S/11S蛋白的熒光強(qiáng)度；[]為EGCG濃度/（mol/L）；為結(jié)合常數(shù)；為結(jié)合位點(diǎn)。

圖4 不同溫度下7S（A）、11S（B）與EGCG相互作用的雙對(duì)數(shù)回歸曲線Fig. 4 Double logarithmic regression curves for the interaction of EGCG with 7S (A) and 11S (B) at different temperatures

如圖4和表2所示，在相同溫度下，7S蛋白的值比11S蛋白低，這表明11S蛋白與EGCG的結(jié)合能力更高。7S/11S蛋白的值隨著溫度的升高而降低，這表明7S/11S蛋白與EGCG的反應(yīng)是一個(gè)放熱反應(yīng)，升高溫度不利于大豆蛋白-EGCG復(fù)合物穩(wěn)定性的提高。在298、304 K和310 K溫度下，7S/11S蛋白的值近似接近于單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，表明大豆蛋白和EGCG能夠以1∶1的物質(zhì)的量比形成穩(wěn)定的靜態(tài)復(fù)合物；此外，觀察到7S/11S蛋白的值大小與值趨勢(shì)一致，進(jìn)一步說(shuō)明與7S蛋白相比，11S蛋白與EGCG之間的親和力更高。

表2 不同溫度下7S和11S與EGCG結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)及線性相關(guān)系數(shù)Table 2 Apparent binding constants, number of binding sites and linear correlation coefficients for the interaction of 7S and 11S with EGCG at different temperatures

2.2.4 熱力學(xué)參數(shù)與相互作用類型判斷

大豆蛋白與EGCG之間的相互作用可能涉及不同類型的結(jié)合力，這主要是由一種或多種結(jié)合力驅(qū)動(dòng)的。為進(jìn)一步探究大豆蛋白與EGCG相互作用的主要結(jié)合力，通過(guò)Van’t Hoff方程（3）、（4）計(jì)算了包括吉布斯自由能變（?）、焓變（?）、熵變（?）在內(nèi)的熱力學(xué)參數(shù)。

式中：為實(shí)驗(yàn)溫度/K；R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)。

如表3所示，所有Δ值均為負(fù)值，表明大豆蛋白與EGCG的結(jié)合是自發(fā)過(guò)程。同時(shí)，根據(jù)Li Yuting等的研究，7S/11S蛋白的?和?值均為負(fù)值，這表明氫鍵和范德華力在大豆蛋白與EGCG的結(jié)合中起關(guān)鍵作用。劉勤勤等報(bào)道了類似發(fā)現(xiàn)并指出茶多酚與SPI之間的結(jié)合主要依靠范德華力和氫鍵驅(qū)動(dòng)，在EGCG與米糠蛋白相互作用中也發(fā)現(xiàn)了類似的報(bào)道。這可能是由于EGCG含有兩種活性基團(tuán)：沒(méi)食子?；头恿u基，且酚羥基數(shù)量較多，可以形成大量的氫鍵與大豆蛋白進(jìn)行結(jié)合。然而，與其他類似的文獻(xiàn)報(bào)道不同，Zhang Jing等研究了7S/11S蛋白與VB的相互作用，發(fā)現(xiàn)疏水作用是主要的結(jié)合力；在Ren Cong等的研究中發(fā)現(xiàn)，7S/11S蛋白與矢車菊素-3--葡萄糖苷之間的相互作用力主要是靜電相互作用。大豆蛋白和EGCG等其他酚類物質(zhì)的相互作用受其自身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和各種因素影響，其他作用力也可能同時(shí)參與結(jié)合的過(guò)程。未來(lái)的研究應(yīng)結(jié)合其他技術(shù)手段進(jìn)一步研究大豆蛋白與EGCG之間的相互作用。

表3 不同溫度下EGCG與7S、11S結(jié)合的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for the interaction of 7S and 11S with EGCG at different temperatures

2.3 外源性熒光光譜分析

在有和無(wú)EGCG的情況下，可以通過(guò)7S/11S蛋白的ANS結(jié)合相對(duì)熒光強(qiáng)度表征其表面疏水性。如圖5所示，相比于7S蛋白，11S具有較高的表面疏水性，這可能歸因于11S蛋白中疏水性和不帶電荷的氨基酸含量較高，從而使11S蛋白具有較高的熒光強(qiáng)度。7S/11S蛋白的表面疏水性隨著EGCG濃度的增加而逐漸降低。其降低結(jié)果可能歸因于3個(gè)主要原因：首先，當(dāng)EGCG與7S/11S蛋白的疏水區(qū)域結(jié)合時(shí)，EGCG干擾了ANS疏水性探針與疏水性氨基酸殘基結(jié)合，使其兩者的結(jié)合的可能性降低；其次，EGCG具有多個(gè)酚羥基，當(dāng)EGCG與7S/11S蛋白結(jié)合時(shí)，由EGCG引入的額外羥基會(huì)增加7S/11S蛋白的表面親水性；同時(shí)，由于EGCG與7S/11S蛋白的相互作用改變了7S/11S蛋白構(gòu)象，一些埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的親水區(qū)域可能會(huì)由于蛋白質(zhì)分子的部分展開(kāi)而暴露于蛋白質(zhì)表面，這可能也是7S/11S蛋白與EGCG相互作用后表面疏水性降低的一個(gè)原因。相同的結(jié)果在Ren Cong等的研究中也有報(bào)道：矢車菊素-3--葡萄糖苷與大豆蛋白的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的下降。此外，11S蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度下降的更加明顯，進(jìn)一步說(shuō)明11S蛋白與EGCG之間的相互作用更強(qiáng)。

圖5 298 K條件下7S（A）、11S（B）與EGCG相互作用的表面疏水性Fig. 5 Effect of interaction with EGCG on surface hydrophobicity of 7S (A) and 11S (B) at 298 K

2.4 EGCG對(duì)大豆7S/11S蛋白FTIR光譜的影響

圖6 7S和11S及其與EGCG復(fù)合物的全局（A）、酰胺I（B）和酰胺II（C）FTIR光譜Fig. 6 Global FTIR spectra (A), amide I spectra (B) and amide II spectra (C) of 7S and 11S and their complexes with EGCG at pH 7.0

應(yīng)用FTIR光譜法研究大豆蛋白-EGCG復(fù)合物，以了解形成復(fù)合物的相互作用以及添加EGCG后對(duì)大豆蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。酰胺A帶（3 300 cm附近）代表分子間的氫鍵以及O—H和N—H的拉伸振動(dòng)，酰胺B帶（2 960 cm附近）代表蛋白質(zhì)的C—H拉伸振動(dòng)。酰胺I帶（1 700～1 600 cm）和酰胺II帶（1 540 cm附近）分別是由蛋白質(zhì)C＝O拉伸振動(dòng)、N—H彎曲和C—N拉伸所導(dǎo)致。如圖6所示，EGCG的添加，7S/11S蛋白的酰胺A帶、酰胺B帶、酰胺I帶和酰胺II帶位置均發(fā)生了偏移，通過(guò)改變酰胺I帶和酰胺II帶的位置，可以推斷出大豆蛋白通過(guò)C＝O、C—N和N—H與EGCG結(jié)合；同時(shí)，在酰胺A帶和酰胺B帶位置的變化也證實(shí)了EGCG主要與大豆蛋白形成氫鍵和疏水相互作用。Zhao Qian等研究了膠原蛋白、酪蛋白與沒(méi)食子酸的相互作用，并指出沒(méi)食子酸與蛋白質(zhì)結(jié)合并通過(guò)氫鍵和疏水相互作用形成復(fù)合物。在茶多酚與豆?jié){蛋白相互作用中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論，并表示兩者之間的疏水相互作用和氫鍵能夠影響豆?jié){蛋白的穩(wěn)定性。

7S/11S蛋白及復(fù)合物的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)定量分析結(jié)果如表4所示。-折疊是7S/11S蛋白的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與以往的報(bào)道一致。添加EGCG之后，7S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由-螺旋、-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)?轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲；這與Sui Xiaonan等的研究結(jié)果一致。而11S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由-折疊、-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變?yōu)?螺旋、無(wú)規(guī)卷曲，這與Zhou Siduo等的研究結(jié)果一致。無(wú)規(guī)卷曲是一種無(wú)序結(jié)構(gòu)，無(wú)序結(jié)構(gòu)的增多表明了蛋白質(zhì)的解折疊。在大豆蛋白與多酚的相互作用中，相關(guān)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化未得出一致的結(jié)論。橙皮苷結(jié)合7S蛋白能夠誘導(dǎo)-折疊向-轉(zhuǎn)角與-螺旋轉(zhuǎn)變，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)呈現(xiàn)較松散的構(gòu)象狀態(tài)；在7S/11S蛋白與VB相互作用中，VB促進(jìn)7S/11S蛋白的-螺旋、-折疊和-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的增加，進(jìn)而增強(qiáng)大豆蛋白質(zhì)構(gòu)象的致密性。矢車菊素-3--葡萄糖苷的添加，使得7S/11S蛋白中的-折疊結(jié)構(gòu)向-螺旋、-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這可能是多酚與大豆蛋白質(zhì)構(gòu)象、結(jié)合量與結(jié)合方式的不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部氫鍵重排，對(duì)蛋白質(zhì)氫鍵和疏水作用有干擾作用，從而導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同的變化，在膠原蛋白/酪蛋白-單寧酸、-酪蛋白/-酪蛋白-藍(lán)莓花色苷，乳球蛋白/-酪蛋白-木糖醇等相互作用研究中也觀察到了類似的趨勢(shì)。此外，與未處理的7S/11S蛋白相比，所有添加了EGCG的7S/11S蛋白樣品均顯示出-折疊相對(duì)含量的降低，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量的升高。7S蛋白的無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量比11S蛋白增加更多，7S蛋白的-折疊相對(duì)含量比11S蛋白的減少更多。EGCG可能會(huì)對(duì)7S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)有更大的影響，這可能與蛋白質(zhì)的固有的構(gòu)象有關(guān)。11S蛋白是一個(gè)具有較高聚集度和分子質(zhì)量的六聚體蛋白；而7S蛋白是一個(gè)三聚體，具有較低的聚集度與分子質(zhì)量，且有較大比例的柔性結(jié)構(gòu)的蛋白。當(dāng)EGCG作用于7S/11S蛋白時(shí)，由于7S蛋白較低的聚集度，可能會(huì)更好的作用于7S蛋白，使其無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量增加更多。這與Wang Yuting等的結(jié)果一致，并表示超聲處理后的7S/11S蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化有較大的差異，這可能與蛋白質(zhì)之間構(gòu)象不同有關(guān)?？傊?，F(xiàn)TIR光譜分析表明，EGCG與7S/11S蛋白結(jié)合并通過(guò)氫鍵和疏水相互作用形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致大豆蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變。此外EGCG會(huì)誘導(dǎo)7S/11S蛋白質(zhì)解折疊，使得-折疊向無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量的增加可能有利于大豆蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改善。

表4 7S和11S及其與EGCG的復(fù)合物在pH 7.0條件下的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 4 Secondary structure analysis of 7S and 11S and their complexes with EGCG at pH 7.0

2.5 大豆7S/11S蛋白-EGCG分子對(duì)接分析

分子對(duì)接是一種有效的分子互作分析方法，可以提供更多有關(guān)EGCG與7S/11S蛋白之間相互作用的信息。如表5所示，Δ為負(fù)值，表明EGCG與7S/11S蛋白的反應(yīng)是自發(fā)結(jié)合的，并且發(fā)現(xiàn)大豆11S蛋白Δ大于7S蛋白Δ，表明EGCG與11S蛋白之間親和力更高。是Δ的主要結(jié)合能來(lái)源，這表明包括范德華力、氫鍵和疏水相互作用在內(nèi)的多種非共價(jià)相互作用力參與了復(fù)合物的形成。負(fù)值的還表明靜電相互作用對(duì)大豆蛋白和EGCG之間的結(jié)合具有一定的貢獻(xiàn)，但不是主要的驅(qū)動(dòng)力，這與熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算一致。此外，與11S蛋白相比，7S蛋白具有較多的帶電氨基酸，帶電氨基酸殘基電荷密度高，更強(qiáng)。氨基酸分布如圖7所示，EGCG位于大豆蛋白的疏水腔，并被一些疏水性和親水性氨基酸殘基包圍。在7S蛋白中，共有13個(gè)殘基參與了對(duì)接，其中，EGCG中的羥基與Asn-317、Glu-219、Asn-316、Ala-314、Asp-327和Asn-805殘基相互作用形成8個(gè)氫鍵。與7S蛋白類似，11S蛋白中共有10個(gè)殘基參與了與EGCG的對(duì)接，其中Arg-522、Val-523、Asp-531、Glu-533、His-534和Gly-542殘基參與形成了6個(gè)氫鍵。在7S/11S蛋白中，EGCG的結(jié)合行為發(fā)生在蛋白質(zhì)的疏水口袋，并觀察到疏水相互作用、氫鍵和范德華力的存在，特別是氫鍵在結(jié)合過(guò)程中起主要作用，這有助于蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)疏水腔內(nèi)EGCG的空間位置的穩(wěn)定。這表明在大豆蛋白分子中通過(guò)多種形式的作用力為大豆蛋白-多酚復(fù)合物提供了必不可少的穩(wěn)定作用。

表5 EGCG與大豆7S/11S蛋白對(duì)接的結(jié)果具體能量數(shù)值Table 5 Energy values for molecular docking of EGCG with 7S/11S

圖7 7S（A）、11S（C）與EGCG結(jié)合位點(diǎn)及7S氨基酸殘基（B）、11S氨基酸殘基（D）與EGCG相互作用圖Fig. 7 Binding sites between 7S (A)/11S (C) and EGCG, and interaction of amino acid residues in 7S (B)/11S (D) with EGCG

3 結(jié) 論

通過(guò)熒光光譜、紫外吸收、FTIR光譜和分子對(duì)接等分析了EGCG與7S/11S蛋白的相互作用的機(jī)理及兩者之間相互作用的差異比較。結(jié)果顯示，在中性條件下，EGCG可與7S/11S蛋白發(fā)生動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅，主要通過(guò)氫鍵與范德華力以物質(zhì)的量比1∶1自發(fā)的結(jié)合形成復(fù)合物，并使得7S/11S蛋白表面疏水性下降；與7S蛋白相比，11S蛋白的猝滅效率、值更高且表面疏水性下降得更為明顯，EGCG對(duì)11S蛋白具有更高的親和力；FTIR光譜和分子對(duì)接結(jié)果表明除氫鍵，疏水相互作用在EGCG與7S/11S蛋白相互作用中起著重要作用；EGCG的添加能夠引起7S/11S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)不同的改變，主要表現(xiàn)為-折疊的減少與無(wú)規(guī)卷曲的增加，導(dǎo)致大豆蛋白發(fā)生解折疊。